Sinh học phân tử_Bài 1
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, vitamin,
muối khoáng… rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc
độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật, nếu
trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì chỉ
sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ
đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong điều
kiện này mô nuôi...
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
BÀI 1:
MỞ ĐẦU
1. CÁC THIẾT BỊ CƠ BẢN CỦA MỘT PHÒNG THÍ NGHIỆM
NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT
a. Phòng rửa và cất nước
- Máy cất nước 1 lần
- Máy cất nước 2 lần
b. Phòng hấp – sấy
- Autoclave
- Tủ sấy 60 – 200 0C
c. Phòng chuẩn bị môi trường
- Cân phân tích (chính xác đến 0,0001 g)
- Cân kỹ thuật (chính xác đến 0,01 g)
- pH kế
- Máy khuấy từ
- Tủ lạnh
- Lò vi sóng (microwave)
d. Phòng thao tác nuôi cấy
- Tủ cấy vô trùng (laminar)
- Quạt thông gió
- Đèn tử ngoại treo tường
e. Phòng nuôi cây
- Các giàn kệ có gắn đèn huỳnh quang
- Máy điều hòa nhiệt độ
- Máy lắc nằm ngang
- Tủ ấm
f. Phòng thí nghiệm:
(phòng này dùng để tiến hành các phân tích sinh hóa, phân tử và di truyền)
- Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần)
- Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần)
- Microtome
- Máy ảnh kỹ thuật số
- Hệ thống đèn chiếu
- Quang phổ kế …
16
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
2. CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BẢO THÀNH CÔNG TRONG NUÔI CẤY
MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
Có 3 nhân tố chính:
- Bảo đảm điều kiện vô trùng
- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách
- Chọn mô cấy và xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.
2.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, vitamin,
muối khoáng… rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc
độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật, nếu
trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì chỉ
sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ
đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong điều
kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần.
2.2 Nguồn tạp nhiễm
Có 3 nguồn tạp nhiễm chính:
- Dụng cụ thuỷ tinh, môi trường nuôi cấy và nút đậy không được vô
trùng tuyệt đối
- Trên bề mặt hoặc bên trong mô cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử nấm
hoặc vi khuẩn
- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên bề
mặt môi trường
2.3 Kỹ thuật vô trùng
2.3.1 Vô trùng dụng cụ thuỷ tinh, nút đậy và môi trường
a. Dụng cụ thuỷ tinh
Thông thường các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm thường
được xử lý bằng dung dịch sulfocromate một lần đầu trước khi đưa vào sử
dụng; về sau chỉ cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước cất và để
thật ráo trước khi sử dụng.
Trong trường hợp các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm nuôi
cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi vô trùng, có thể khử trùng trong tủ sấy ở
nhiệt độ cao trong nhiều phút hoặc nhiều giờ. Các dụng cụ này luôn được gói
17
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
trong giấy nhôm hoặc hộp kim loại để tránh bị nhiễm trở lại sau khi đã khử
trùng.
Bảng 1.1: Thời gian khử trùng dụng cụ thuỷ tinh bằng nhiệt và nhiệt độ khử
trùng
Nhiệt độ (oC) Thời gian khử trùng
(phút)
160 45
170 18
180 7,5
190 1,5
b. Nút đậy
Thường dùng nhất là các nút đậy làm bằng bông gòn không thấm nước.
Nút phải tương đối chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thời nước từ
môi trường không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông
không thấm nước là loại nút đơn giản nhất nhưng có các nhược điểm sau:
- Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ rất
dễ bị nhiễm nấm, nhất là với những thí nghiệm tiến hành trong một thời
gian dài
- Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên qui
mô lớn
- Chỉ dùng được vài lần là phải bỏ
Hiện nay người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay thế nút bông.
Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm và
bình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C mà
không bị biến dạng. Một số phòng thí nghiệm dùng nắp ống nghiệm bằng
inox hoặc cao su rất thuận tiện cho việc vô trùng khô hoặc ướt. Cũng có thể
sử dụng giấy nhôm để làm nắp đậy…
c. Môi trường
Môi trường nuôi cấy thường được hấp khử trùng trong nồi hấp
(autoclave), khử trùng bằng áp suất hơi nước bão hòa. Thời gian hấp từ 15-30
phút ở áp suất hơi nước bão hòa là 103,4 kPa (1atm) tương đương với nhiệt
độ 1210C. Ở nhiệt độ 1210C, hầu hết các sinh vật có trong môi trường đều bị
18
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
tiêu diệt, kể cả ở dạng bào tử. Sau khi vô trùng cần phải làm khô nắp ống
nghiệm hoặc nút bông để tránh bị nhiễm trở lại.
Bảng 2: Thời gian khử trùng dung dịch và các môi trường lỏng bằng
nồi hấp (autoclave) ở 121oC tại 103,4 kPa
Thể tích môi trường (mL) Thời gian hấp khử trùng
(phút)
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
Phương pháp sử dụng màng lọc Millipore: hãng Millipore cung cấp
màng lọc và giá đỡ bằng nhựa chịu nhiệt. Dưới đây mô tả màng lọc loại
Millipore Swinex có đường kính 25mm. Bộ lọc gồm có giá đỡ bằng loại nhựa
chịu nhiệt gồm nắp và đế, vòng cao su và màng lọc. Đặt màng lọc (có kích
thước lỗ 0,25µm) trên đế, đặt vòng cao su lên và vặn chặt nắp vào đế. Gói
toàn bộ bộ lọc vào trong một tờ giấy nhôm và khử trùng trong autoclave ở
1210C trong 15-20 phút. Đồng thời cũng hấp vô trùng một bình thuỷ tinh để
hứng dịch lọc. Dùng ống tiêm hút dịch lọc và bơm qua bộ lọc.
2.3.2 Khử trùng mô thực vật
Mô cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt
giống, phôi, noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ…tuỳ theo sự tiếp xúc với môi
trường bên ngoài, các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Đòng
lúa non khi còn trong bẹ, mô thịt bên trong quả… thường ít bị nhiễm vi sinh
vật; ngược lại, lá, thân đặc biệt ở các bộ phận nằm sâu trong đất như rễ, củ…
có lượng nấm, khuẩn tạp rất cao. Hầu như không thể vô trùng mô cấy được
nếu nấm, khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong mô chứ không hạn chế ở bề
mặt. Lá khoai lang có thể vô trùng dễ dàng trong mùa khô nhưng không thể
làm được trong mùa mưa.
Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các
chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các
chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của
chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt
khí bám trên bề mặt mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập
của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô cấy trong vòng 30s trong
rượu ethylic 70% sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn. Đồng thời người ta
thêm các chất giảm sức căng bề mặt như Tween 80, Fotoflo, Teepol vào dung
dịch diệt nấm khuẩn. Để có khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các
chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy, xin dẫn tài liệu nghiên cứu của Street
(1974) ở bảng sau:
20
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
Tác nhân vô Nồng độ % Thời gian xử lý Hiệu quả
trùng ( phút)
Calci hypochlorit 9 – 10 5 – 30 Rất tốt
Natri hypochlorit 2 5 – 30 Rất tốt
Hydro peroxid 10 – 12 5 – 15 Tốt
Nước Brom 1–2 2 – 10 Rất tốt
HgCl2 0.1 - 1 2 – 10 Trung bình
Chất kháng sinh 4 – 50 mg/l 30 – 60 Khá tốt
Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt
khuẩn. Đối với các bộ phận có nhiều bụi cát, trước khi xử lý nên rửa cẩn thận
bằng nước xà phòng bột và rửa sạch lại bằng nước máy. Khi xử lý xong, mô
cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (tối thiểu là 3 lần). Những
phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải được cắt bỏ
trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh hưởng của tác nhân vô
trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung
dịch diệt khuẩn. Lớp ngoài cùng này sẽ được lột bỏ đi trước khi đặt mô cấy
lên môi trường.
Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay từ lần đầu
tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp
thì sau vài lần thử chắc chăn sẽ đạt kết quả.
Có thể dùng kháng sinh để kiểm soát hoặc loại bỏ sự nhiễm nấm trên
mô cấy. Hầu hết các kháng sinh nhạy cảm với nhiệt do đó không thể hấp vô
trùng. Chúng hoà tan được trong nước hoặc dung môi thích hợp khác, lọc vô
trùng và thêm vào môi trường vô trùng khi môi trường này đã được làm nguội
còn 45-50oC. Không phải tất cả các kháng sinh đều thích hợp cho sử dụng
trong nuôi cấy mô thực vật. Các kháng sinh như Streptomycin, Kanamycin và
Neomycin thường độc cho mô thực vật và không hoạt động tốt trong một
phạm vi pH nhất định. Tetracylin cũng là độc tố thực vật, có khuynh hướng
ức chế sự tăng trưởng của mô thực vật sau khi bị xử lý trong một thời gian
dài. Chloramphenicol có phổ hoạt động rộng nhưng độc cho thực vật (và
người) ở nồng độ thấp. Các kháng sinh thường được dùng trong nuôi cấy mô
thực vật gồm Rifampicin (thường được dùng kết hợp với các kháng sinh
khác), các polymicin và vancomycin.
21
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
Các loại kháng sinh Khả năng hoạt động
Aminoglycoside Ức chế sự sinh tổng hợp
- Streptomycin protein bằng cách tác động
- Kanamycin lên các ribosome 30S hoặc
- Neomycin 50S
Quinolone Gây trở ngại cho quá trình
- Nalidixic acid sao chép DNA bằng cách ức
- Ofloxacin chế enzym DNA gyrase
- Norfloxacin
β-Lactam Ức chế sự tổng hợp vách tế
- Penicillin bào vi khuẩn
- Ampicillin
- Carbenicillin
Tetracyclin Ức chế sinh tổng hợp protein
bằng cách tác động lên
ribosome 30S
Trimehtoprim và sulphonamide Ức chế sự sinh tổng hợp
tetrahydrofolate
Chloramphenicol Ức chế sự sinh tổng hợp
protein bằng cách tác động
lên Rbx 50S
Macrolide và lincosamide Ức chế sự sinh tổng hợp
- Erythromycin protein bằng cách tác động
- Lincomycin lên Rbx 50S
Glycopeptide Tác động lên sự sinh tổng
- Vancomycin hợp vách tế bào vi khuẩn
Polymixin Gắn lên màng tế bào làm
- Polymixin B thay đổi dòng ion dẫn đến sự
- PolymicinE phá vỡ tế bào
Rifampicin Tác động lên RNA bằng cách
gắn vào RNA polymerase
2.3.3 Kỹ thuật cấy vô trùng
Để tránh bị nhiễm trong suốt thao tác cấy mô thực vật, các nhà khoa
học làm việc trong tủ cấy vô trùng (laminar). Đó là các tủ cấy có thiết bị thổi
22
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
không khí đã lọc vô trùng vào chỗ thao tác cấy. Tủ cấy vô trùng loại trừ một
cách hiệu quả nguồn tạp nhiễm từ bên ngoài và tạo điều kiện thoải mái cho
người cấy, nên hiện nay được sử dụng rất phổ biếân trong các phòng thí
nghiệm. Không khí từ bên ngoài được quạt hút vào qua một màng lọc thô.
99% bụi trong không khí được giữ lại ở màng lọc thô. Sau đó không khí được
thổi qua màng lọc tinh và phân phối đều ra khắp bề mặt của tủ cấy, không tạo
những xoáy không khí đưa bụi vào chỗ cấy. Màng lọc tinh ngăn cản các phần
tử lớn hơn 0.3micron với hiệu quả 99,99% và do các hãng chuyên sản xuất
màng lọc cung cấp. Tuổi thọ của màng lọc thô tuỳ theo số lượng bụi nơi làm
việc, thường từ 6 tháng đến 1 năm và của màng lọc tinh từ 2 đến 3 năm. Khi
thấy hiệu quả vô trùng của tủ cấy laminar kém đi thì cần phải thay màng lọc
mới. Để kéo dài tuổi thọ của bộ màng lọc trong tủ cấy laminar - thường rất đắt
tiền - nên bố trí tủ cấy trong các phòng riêng, càng ít bụi càng tốt.
2.3.4 Khử trùng nơi thao tác cấy và dụng cụ cấy
Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng
cụ thuỷ tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy.
Người ta áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp
này.
Phòng cấy thường là buồng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15m2, có hai
lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào.
Sàn và tường lát gạch men để có thể lau chùi thường xuyên. Trước khi đưa
vào sử dụng, phòng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cách rót
formaldehyde (formalin) 4% ra một số nắp đĩa petri để rải rác vài nơi trong
phòng cho bốc hơi tự do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24h, sau đó bỏ
formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde còn thừa bằng dung dịch NH3 25%
cũng trong 24h.
Bề mặt nơi chuẩn bị cấy, bề mặt bên trong và ngoài tủ cấy phải được
khử trùng trước khi cấy bằng cách lau sạch các bề mặt này bằng cồn 90%. Tia
UV cũng có thể được sử dụng để khử trùng bề mặt phòng cấy và tủ cấy nhưng
nó ít hiệu quả hơn và nguy hiểm hơn là sử dụng cồn. Tia UV chỉ tiêu diệt
được các mầm vi sinh nằm trực tiếp ngay trên các bề mặt mà tia này chiếu
vào; nhưng nó không thể thấm qua các lớp bụi để tiêu diệt các vi sinh vật nằm
bên dưới các lớp bụi này. Tia UV còn gây hại cho mắt và gây ung thư da.
Các dụng cụ mang vào phòng cấy đều vô trùng trước: từ áo choàng, mủ
vải, khẩu trang của người cấy đến dao, kéo, kẹp (forceps), giấy lọc, bình đựng
23
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
nước cất... Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng trong khi
cấy và một cốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc.
Trước khi cấy, người cấy cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến
khuỷu tay bằng cồn 90%. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao trong phòng cấy
cần có một đèn tử ngoại 40W treo trần. Chỉ cho đèn này làm việc khi không
có người trong phòng cấy. Nên bật đèn tử ngoại 30 phút trước khi cấy. Cần
giảm sự chuyển động của không khí trong phòng cấy đến mức tối thiểu, vì
vậy tất cả các dụng cụ phục vụ cho việc cấy đều phải chuẩn bị đầy đủ để trong
thời gian cấy tránh đi lại ra vào phòng cấy quá nhiều.
Các dụng cụ bằng kim loại như kẹp cấy, dao mổ, que cấy vòng, kim
mũi nhọn có thể được khử trùng bằng cách đốt dưới ngọn lửa đèn cồn. Những
dụng cụ này trước hết phải được nhúng vào cồn tuyệt đối rồi mới đốt. Nhớ để
ráo đi các giọt cồn thừa rồi mới đưa vào ngọn lửa đèn cồn.
Khi mở nắp chai hoặc nắp ống nghiệm môi trường nuôi cấy, thì dùng
ngón tay kế út và ngón tay út cầm lấy nắp gòn, và không chạm tay vào bề mặt
bên trong của nắp gòn cũng như không thả nắp gòn xuống bất cứ bề mặt nào
cho đến khi gắn nó trở lại chai môi trường.
24
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
BÀI 2:
KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG
1. VẤN ĐỀ LỰA CHỌN MÔI TRƯỜNG
Khi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào đối với một số đối tượng nhất định,
vấn đề đặt ra là chọn môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỷ lệ các
chất dinh dưỡng. Cách thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản, các công
trình đã nghiên cứu về đối tượng đó hoặc cùng họ tương đương xem các tác
giả đã sử dụng môi trường loại nào. Bước đầu có thể giữ nguyên môi trường
của tác giả đó hoặc trên cơ sở đó mà cải tiến cho phù hợp qua các thí nghiệm
thăm dò.
Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại
cây khác nhau, nhiều mục đích nuôi cấy khác nhau. Về cơ bản có thể chia ra
làm 3 loại:
- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là môi truờng White,
Knop và Knudson C …
- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: điển hình là
môi trường B5 của Gamborg …
- Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình là môi trường MS
(Murashige-Skoog)…
Vì vậy khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, chưa
có tài liệu trước thì nên thăm dò so sánh 3 loại môi trường trên xem đối tượng
nghiên cứu phù hợp với loại môi trường nào nhất.
Sau đó cần thử tìm tỉ lệ NO3- / NH4+ thích hợp. Các tác giả phương Tây
làm việc với cây trồng cạn thường không đưa NH4+ vào môi trường. Nhưng
đối với những cây dinh dưỡng NH4+ mạnh như cây lúa, việc thêm vào môi
trường nuôi cấy một tỉ lệ NH4+ thích hợp chắc chắn sẽ có lợi.
Việc sử dụng mang tính kinh nghiệm chủ nghĩa đối với một số môi
trường đã cản trở khá nhiều sự tiến bộ của công tác ở một số phòng thí
nghiệm nuôi cấy mô thực vật. Thuốc lá và carốt là 2 loại cây kinh điển của
nuôi cấy mô thực vật. Môi trường nuôi cấy 2 loại cây này đã được xây dựng
khá hoàn chỉnh. Tuy vậy, không thể dùng nguyên các môi trường đó để
nghiên cứu các cây hoà thảo hoặc các cây họ đậu mà không có sự cải tiến, sửa
đổi. Điều này giải thích sự tiến bộ chậm chạp của nuôi cấy mô một số cây
hoà thảo so với cây 2 lá mầm.
25
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
Hiện nay, môi trường MS được coi như là môi trường thích hợp với
nhiều loại cây do giàu và cân bằng về mặt dinh dưỡng. Vì vậy, những người
tập sự làm nuôi cấy mô thường bắt đầu với môi trường này trước khi tìm được
môi trường của riêng mình.
2. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG
Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy người ta không cân
hoá chất mỗi lần pha mà thường chuẩn bị trước dưới dạng các dung dịch đậm
đặc (còn gọi là các stock), sau đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng. Các stock
này thường được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu.
2.1 Thành phần môi trường dinh dưỡng
Nước cất
Chất hữu cơ Chất vô cơ
- Đường Đa lượng Vi l ư ợng
- Acid amin N Fe Mn
- Vitamin (B1, B6, H, PP…) P Zn Cu
- Các chất điều hòa sinh trưởng K B Al
thực vật (Auxin, Cytokinin, Ca Co Mo
Gibberellin…)
Mg Ni I
S
Các hợp chất Nước dừa, nước khoai tây, nước chuối, casein
không biết rõ hydrolysalt, trypton, pepton…
thành phaàn
THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠ BẢN CỦA MÔI TRƯỜNG MS
(Murashige và Skoog, 1962)
NH4NO3 1650 mg/L
KNO3 1900 mg/L
SKOOG I KH2PO4 170 mg/L
MgSO4.7H2O 370 mg/L
CaCl2.2H2O 440 mg/L
26
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
SKOOG II Na2EDTA 37,3 mg/L
FeSO4.7H2O 27,8 mg/L
MnSO4.4H2O 22,3 mg/L
H3BO3 6,2 mg/L
ZnSO4.7H2O 8,6 mg/L
SKOOG III KI 0,83 mg/L
Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/L
CuSO4.5H2O 0,025 mg/L
CoCl2.6H2O 0,025 mg/L
THÀNH PHẦN VITAMIN CỦA MOREL
Pirydoxine (B6) 1 mg/L
Biotin (H) 0,01 mg/L
Morel’s Meso-inositol 100 mg/L
Vitamin
Nicotinic acid (P.P) 1 mg/L
Thiamin –HCl (B1) 1 mg/L
Pantotate Calci 1 mg/L
2.2 Cách pha các dung dịch mẹ (stock)
* Stock đa lượng MS : SKOOG I (x10)
(Pha thành 1Lvới nồng độ sử dụng khi pha 1Lmôi trường MS là 100
mL/L)
NH4NO3 16500 mg
KNO3 19000 mg
KH2PO4 1700 mg
MgSO4.7H2O 3700 mg
CaCl2.2H2O 4400 mg
27
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
Cân và dùng nước cất hoà tan lần lượt từng chất trong bécher cho
tan hoàn toàn. Dùng ống đong 1L điều chỉnh cho đủ 1 lít.
* Stock sắt MS: SKOOG II (x100)
(Pha thành 200mL với nồng độ sử dụng khi pha 1L mội trường MS là 2
mL/L)
Na2EDTA 3730 mg
FeSO4.7H2O 2780 mg
Cân và hoà tan từng chất bằng 100mL nước cất trong mỗi bécher riêng.
Đặt 2 bécher dung dịch lên bếp và gia nhiệt cho dung dịch ấm lên vừa có hơi
nóng bốc lên là được. Khuấy đều và đổ dung dịch Na2EDTA vào ống đong
200 mL, rồi cho từ từ dung dịch FeSO4 vào, vừa cho vừa khuấy đều. Để nguội
rồi cho vào bình tối bảo quản trong tủ lạnh.
* Stock vi lượng MS: SKOOG III (x100)
Trước tiên cần chuẩn bị các stock con:
Dung dịch KI: (83mg/mL)
Cân 8300 mg KI hoà tan với nước cất cho đủ 100mL
Dung dịch Na2MoO4.2H2O: (25mg/mL)
Cân 2500mg Na2MoO4.2H2O hoà tan với nước cất cho đủ 100mL
Dung dịch CuSO4.5H2O (2,5mg/mL)
Cân 250mg CuSO4.5H2O hòa tan với nước cất cho đủ 100mL
Dung dịch CoCl2.6H2O (2,5 mg/mL)
Cân 250 mg CoCl2.5H2O hòa tan với nước cất cho đủ 100 mL
SKOOG III (x100): pha thành 500mL với nồng độ sử dụng khi pha 1L môi
trường MS là 5mL/L
MnSO4.4H2O 2230 mg 2230 mg
H3BO3 620 mg 620 mg
ZnSO4.7H2O 860 mg 860 mg
KI 83 mg 1 mL
Na2MoO4.2H2O 25 mg 1 mL
CuSO4.5H2O 2,5 mg 1 mL
28
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
CoCl2.6H2O 2,5 mg 1 mL
Cân 3 chất đầu tiên và hoà tan với nước cất trong từng bécher riêng.
Cho từng dung dịch theo thứ tự vào ống đong 500mL. Sau đó hút 1mL dung
dịch trong stock con của 4 chất tiếp theo cho vào ống đong, vừa cho vừa
khuấy đều và thêm nước cất cho đủ 500mL
* Thành phần vitamin
Pha các stock con
Dung dịch pirydoxine (B6) (10mg/mL)
Cân 1000mg B6 hòa tan với nước cất cho đủ 100mL
Dung dịch Biotin (H) (1mg/mL)
Cân 100mg biotin hòa tan với nước cất cho đủ 100 mL
Dung dịch Nicotinic Acid (P.P) (10mg/mL)
Cân 1000 mg nicotinic acid hòa tan với nước cất cho đủ 100mL
Dung dịch Thiamin-HCl (B1) (10mg/mL)
Cân 1000 mg B1 hoà tan với nước cất cho đủ 100 mL
Dung dịch Pantotheate-Ca (10mg/mL)
Cân 1000 mg Pantotheate-Ca hòa tan với nước cất cho đủ 100mL
Vitamin Morel (x 100)
Pirydoxine (B6) 100 mg 10mL
Biotin (H) 1 mg 1 mL
Meso-inositol 10 g 10 g
Nicotinic acid 100 mg 10 mL
(P.P)
Thiamin –HCl 100 mg 10 mL
(B1)
Pantotate Calci 100 mg 10 mL
29
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
Cân meso-inositol rồi hòa tan với nước cất. Đong từng chất theo thứ tự
cho vào ống đong có chứa nước cất , vừa cho vừa khuấy đều và thêm nước
cho đủ 200mL
* Thành phần các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (tính theo mg)
Dung dịch BAP (1mg/mL)
Cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hoà tan trong 5mL NaOH 1N.
Cho thêm nước cất cho đủ 100 mL. Mỗi mL dung dịch có chứa 1mg BAP
Dung dịch IAA (1mg/mL)
Cân 100mg Indolacetic acid (IAA) hòa tan trong 5 mL NaOH 1N. Cho
thêm nước cất cho đủ 100mL. Mỗi mL dung dịch có chứa 1mg IAA.
Dung dịch IBA (1mg/mL)
Cân 100mg Indolebutyric acid (IBA) hòa tan trong 5mL NaOH 1N.
Cho thêm nước cất cho đủ 100mL. Mỗi mL dung dịch có chứa 1mg IBA
Dung dịch Kinetin (1mg/mL)
Cân 100mg Kinetin (KIN) hòa tan trong 5 mL NaOH 1N. Cho thêm
nước cất cho đủ 100mL. Mỗi mL dung dịch có chứa 1mg KIN.
Dung dịch NAA ( 1mg/mL)
Cân 100mg Naphthaleneacetic acid (NAA) hòa tan trong 5mL NaOH
1N. Cho thêm nước cất cho đủ 100mL. Mỗi mL dung dịch có chứa 1mg
NAA.
Dung dịch 2,4-D (1mg/mL)
Cân 100mg 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) hòa tan trong
50mL ethanol 50%. Cho thêm nước cất cho đủ 100mL. Mỗi mL dung dịch có
chứa 1mg 2,4-D.
* Các dung dịch chất điều hòa sinh trưởng thực vật (tính bằng mol/l)
BAP có trọng lượng phân tử (MW) là 225.26
- Hoà tan 225.26gr BAP trong 1l nước cất tức ta có 1l dung dịch BAP
1M hay 1mol/l
- Cân 225.26 mg BAP hoà tan trong 1l nước cất tức ta có 1l dung dịch
BAP 1mM hay 1mmol/l
- Cân 225.26x10-3 mg BAP hoà tan trong 1l nước cất tức ta có 1l dung
dịch BAP 1µM hay 1µmol/l
30
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
Cách pha các dung dịch mẹ:
Dung dịch BAP ( MW 225.26) (10mM)
Cân 225.26 mg BAP hoà tan trong 5 mL NaOH 1N. cho thêm nước cất
cho đủ 100 mL , tức ta có 100 mL dung dịch BAP 10mM
Ví dụ: Cho 1mL dung dịch BAP 10mM vào môi trường MS để pha
được 1L môi trường. Như vậy ta có 1L môi trường MS có chứa 10µM BAP.
Muốn pha 1Lmôi trường MS có chứa 1µM BAP, ta sử dụng 0.1mL
dung dịch BAP 10 mM.
Tương tự như vậy pha cho các loại kích thích tố còn lại, biết:
- IAA (MW 175.19)
- IBA (MW 203.24)
- Kinetin (MW 215.22)
- NAA (MW 186.21)
- 2,4-D (MW 221.04)
3. THỰC HÀNH
- Tiến hành pha Skoog I, II và III của môi trường MS
- Pha stock vitamin Morel, glycin và inosytol
- Pha các stock chất điều hoà sinh trưởng như đã hướng dẫn phần trên
31
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
BÀI 3:
GIEO HẠT IN-VITRO
1. CHỌN MÔ CẤY VÀ XỬ LÝ MÔ CẤY
1.1 Chọn lựa mô cấy
Không có những hướng dẫn cụ thể trong việc chọn mô cấy. Về nguyên
tắc, trừ những mô cấy đã hóa gỗ, các mô khác trong cơ thể thực vật đều có thể
dùng làm mô cấy. Tuy vậy có thể nhận xét chung là các mô đang phát triển,
thịt quả non, lá non, cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh… khi đặt vào môi
trường có chứa một lượng chất sinh trưởng thích hợp đều có khả năng phân
chia và phân hóa. Để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất
định, trước tiên người ta chú ý đến các chồi nách và mô phân sinh ngọn. Cần
biết rằng tuy mang một lượng thông tin di truyền như nhau, các mô khác nhau
trên cùng một cây có thể sinh trưởng và phát triển với khả năng tái sinh chồi,
rễ hay cây hoàn chỉnh rất khác nhau.
Vì vậy, khi khởi sự chọn giống, nhân giống một cây cụ thể bằng
phương pháp nuôi cấy môvà tế bào thực vật, trước hết cần thí nghiệm tìm
hiểu phản ứng của các bộ phận khác nhau của cấy trong nuôi cấy ở các nồng
độ chất sinh trưởng khác nhau.
Sau khi cấy, mô cấy cần được đặt trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng
ổn định. Tuỳ vào các mục đích nghiên cứu mà có các chế độ chiếu sáng khác
nhau, chẳng hạn quá trình tạo mô sẹo có thể cần bóng tối hay ánh sáng, nhưng
quá trình tái sinh và nhân giống vô tính nhất thiết phải có ánh sáng. Nhiệt độ
phòng nuôi nên giữ ổn định 25+20C bằng máy điều hòa nhiệt độ. Cường độ
chiếu sáng khoảng từ 2000 –3000 lux.
1.2 Xử lý vô trùng mẫu cấy
Mẫu đưa vào nuôi cấy invitro có nhiều nguồn gốc khác nhau. Có thể là
những mẫu cấy đã vô trùng như cây con invitro cho nảy mầm trong điều kiện
vô trùng; cũng có thể đó là các mẫu cấy chưa vô trùng, lấy trực tiếp từ bên
ngoài tự nhiên như chồi non, lá, thân, củ, rễ… Thuận lợi nhất là sử dụng các
mẫu cấy đã vô trùng bởi lẽ các phương pháp vô trùng mẫu cấy trực tiếp
thường ít nhiều gây hại cho mẫu cấy do chất khữ trùng gây ra.
Có nhiều phương thức vô trùng mẫu cấy:
32
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
a. Vô trùng hạt:
- Rửa hạt bằng xà phòng, lắc đều 2-3 phút. Với các loại hạt nhỏ, thường
đựng hạt trong túi vải mùng.
- Rửa sạch xà phòng bằng nước máy dưới vòi nước chảy mạnh
- Vô trùng sơ bộ bằng cồn 70%, lắc đều 1-2 phút
- Rửa sạch cồn bằng nước vô trùng
- Cho hạt vào dung dịch khử trùng NaOCl 1-15%. Thêm vài giọt bám
dính Tween20. Khử trùng trong 15-20 phút tuỳ mẫu.
- Rửa sạch chất khử trùng nhiều lần bằng nước vô trùng (khoảng 5 lần)
cho đến khi hết mùi javel.
- Hạt vô trùng đã có thể nuôi cấy trên môi trường tạo mẫu vô trùng.
b. Các phương thức khác vô trùng hạt
- Khử trùng lần thứ nhất với NaOCl 5,25%
- Khử trùng lần thứ hai với HgCl2 0,1 –1%, thêm vài giọt HCl 0,5%
trong 10 phút.
- Rửa mẫu với H2O2 6% vô trùng trước khi rửa lại bằng nước vô trùng
- Có thể khử trùng sơ bộ hạt bằng acid sulfuric trong 2-10 phút
- Với hạt có vỏ cứng, có thể dùng phương pháp đốt để khử trùng sơ bộ.
c. Vô trùng chồi non, lá và thân cỏ:
- Vô trùng sơ bộ bằng cách ngâm mẫu vào cồn 70% trong 1-3 phút, thời
gian xử lý này cũng còn tuỳ thuộc vào độ cứng hay mềm của mẫu
- Vô trùng mẫu với chất khử trùng NaOCl 1% hay với javel thương
phẩm theo tỉ lệ 1:4 hay 1:5 trong thời gian 5-20 phút tuỳ theo mẫu
- Rửa lại bằng nước vô trùng cho sạch hoàn toàn chất khử trùng
d. Vô trùng củ, rễ
- Mẫu nuôi cấy phải được rửa dưới vòi nước chảy mạnh cho thật sạch đất
cát bám trên mẫu, sau đó ngâm trong nước xà phòng loãng 10 phút
- Vô trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 1-5 phút
- Vô trùng với chất khử trùng có nồng độ và thời gian thay đổi tuỳ mẫu
- Rửa lại bằng nước vô trùng cho thật sạch chất khử trùng
e. Tránh hoại mẫu
Trong quá trình nuôi cây thường xuất hiện nhiễm là do trong quá trình
nuôi cấy đã để bào tử trong không khí rơi vào hay mẫu cấy chưa được vô
trùng hoàn toàn. Sau một thời gian thì bào tử phát triển nhanh chóng và có thể
33
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
sẽ làm chết mẫu hoặc cạnh tranh chất dinh dưỡng làm mẫu không phát triển.
Hoại mẫu thường do nấm mốc (khuẩn lạc có dạng sợi) hoặc do khuẩn (khuẩn
lạc có dạng ván nhầy). Nếu nấm hoặc khuẩn chỉ mọc tr6en bề mặt môi
trường, đó thường là nhiễm do thao tác cấy chưa tốt; nếu có khắp trong môi
trường là nhiễm do môi trường chưa được tiệt trùng hoàn toàn; còn nếu khuẩn
và nấm xuất phát từ gốc mẫu lan ra thì đó là do mẫu chưa được khử trùng triệt
để. Tuỳ theo quan sát và dựa vào kinh nghiệm của người cấy mà có nhận định
chính xác về nguyên nhân gây hoại mẫu để tìm cách khắc phục tình trạng này.
Trong trường hợp các bình nuôi cấy đã bị nhiễm, cần được hấp bỏ trước khi
đem đi rửa sạch để tránh lây lan nguồn nhiễm trong khu vực cấy.
2. THỰC HÀNH
2.1 Mục đích
Giúp cho sinh viên làm quen với thao tác vô trùng mẫu cấy và kỹ thuật cấy vô
trùng
2.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
2.2.1 Dụng cụ:
- Bình tam giác (250mL)
- Giấy cấy vô trùng
- Bécher (cốc đốt thuỷ tinh) 500mL, 1000mL
- Forceps (kẹp), dao cấy, đèn cồn
- Đĩa petri vô trùng
2.2.2 Thiết bị:
- Autoclave
- Tủ sấy
- Tủ cấy (laminar)
- Tủ lạnh
- Cân kỹ thuật
- Máy cất nước 2 lần
- Máy khuấy từ
- pH kế
2.2.3 Hoá chất
- Dung dịch Skoog I, II và III của môi trường MS
- Stock vitamin Morel
34
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
- Stock glycin
- Đường saccharose
- Agar
- Nước cất vô trùng
- Cồn 90%, 70%
- Dung dịch hypochloride calcium 10%
- Xà phòng bột
2.3 Các bước tiến hành
2.3.1 Chuẩn bị môi trường
(thành phần cho 1L môi trường)
- Skoog I (MS):100mL
- Skoog II (MS): 2mL
- Skoog III (MS): 5mL
- Vitamin Morel: 2mL
- Glycine: 2mL
- Sucrose: 30g
- pH :5,8
- Agar:7g
2.3.2 Nguyên liệu thực vật:
- Các hạt cam chanh còn nguyên vẹn, không bị hư hại
2.3.3. Các bước thực hiện
- Cho hạt vào bécher có chứa nước xà phòng loãng, rửa hạt cho sạch chất
nhớt bám xung quanh hạt
- Rửa hạt cho sạch xà phòng bằng nước cất. Ngâm hạt 2phút trong cồn
70%
- Rửa hạt sạch etanol bằng nước cất. Sau đó ngâm hạt 10phút trong dung
dịch hypochloride calcium 10%
- Trong tủ cấy vô trùng, rửa hạt cho sạch chất khử trùng bằng cách lắc
hạt trong nước cất vô trùng (3 lần)
- Tiến hành tách áo hạt bằng kẹp và dao mổ vô trùng. Cho các hạt vừa
tách bỏ vỏ áo vào đĩa petri vô trùng có chứa giấy thấm vô trùng và làm
ẩm giấy thấm bằng một ít nước cất vô trùng.
35
