Sản xuất enzyme protease từ vi sinh vật
Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa
học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến
ở nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn.
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
I- GIỚI THIỆU
Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa
học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến
ở nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn.
Ngoài số enzyme đa được sử dụng rộng rãi và lâu đời( amylaza, prôtêaza…), còn
có hàng chục loại enzyme khác đã được nghiên cứu và áp dụng vào thực tế.
Trước đây, các enzyme dùng nghiên cứu hoặc áp dụng trong sản xuất, thường
thu nhận từ động vật, thực vật. Nhưng vài chục năm gần đây, người ta đã chú ý
đến một nguồn enzyme vô cùng phong phú và rẻ tiền, đó là nguồn enzyme từ vi
sinh vật. Thực ra đây là một nguồn enzyme rất quen thuộc đối với một số nước
phương đông( Trung Quốc, Nhật Bản…).
Để mở rộng việc sử dụng các enzyme vào thực tế ở nước ta và đáp ứng yêu cầu
của một số cơ sở sản xuất trong những năm qua, các nhà khoa học đã tiến hành
nghiên cứu tách và chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, nghiên cứu
các điều kiện thích hợp cho việc tổng hợp mạnh mẽ enzyme của chúng, thu
nhận chế phẩm enzyme .
Các protease khá phổ biến ở động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên sự
phân bố của chúng không đồng đều ở các loài, các mô, các cơ quan khác nhau.
Một số loài, cơ quan và mô của động thực vật có chứa một hay một số protesae
nhất định có thể dùng làm nguồn nguyên liệu để tách các enzyme tương ứng.
Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở
trong tế bào( protease nội bào ) hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy( protease
ngoại bào ). Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kĩ hơn nhiều
so với protease nội bào.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 1
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
Một số protease ngoại bào đã sản xuất trong quy mô công nghiệp và được sử
dụng rộng rãi trong nhiều ngành kĩ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và trong y
học.
Trong bài này chúng tôi xin giới thiệu một phương pháp tách chiết enzyme
prôtêaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
II- CHUẨN BỊ GIỐNG – TẠO SINH KHỐI
2.1. Phân lập giống VSV – Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae.
Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào VSV trong môi trường. Quá trình
này xảy ra ở điều kiện tự nhiên và quá trình sản xuất công nghiệp. Bản chất của
2 quá trình này có thể nói là như nhau nhưng về mặt hình thức và phương diện
thì khác nhau hoàn toàn.
Quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên là một quy luật sống còn của VSV.
Tự tham gia tổng hợp nên chất sống từ vật liệu lên men có trong tự nhiên. Các
VSV và vật chất sử dụng trong quá trình lên men tự nhiên rất phức tạp, không
đồng đều về chủng loại và về số lượng. Mặt khác, quá trình lên men này không
được kiểm soát, bao gồm nhiều pha và không định hướng. Sản phẩm lên men là
đa dạng, không ổn định; do dó, chất lượng sản phẩm kém không đồng nhất.
Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu về phân lập giống
VSV, cơ chất, nhiệt độ, pH, độ ẩm… các quá trình phản ứng sinh học, quá trình
thu nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn ( Sản phẩm tạo ra
mang tính định hướng rõ ràng ngay từ lúc đầu ở khâu chọn giống VSV cho đến
cuối quá trình thu nhận sản phẩm ) . Do đó chất lượng sản phẩm được cải thiện
.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 2
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
2.1.1. Vai trò của giống trong công nghệ enzyme.
Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:
Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy.
-
Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học ( hay là
-
hoạt tính enzyme).
Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất.
-
Và cuối cùng là giống VSV quyết định đến giá thành sản phẩm.
-
Như vậy, giống VSV có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ VSV.
2.1.2. Yêu cầu giống VSV trong công nghiệp enzyme.
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được
sản xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống VSV ứng dụng trong công nghệ
enzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó là:
Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này phải
-
có số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong quá trình
trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng
nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSV
cần tổng hợp nhiều chất. Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác.
Chính vì thế, giống VSV dùng trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản
phẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số lượng và chất lượng.
Giống phải cho năng suất sinh học cao.
-
Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong
-
điều kiện sản xuất công nghiệp.
Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ
-
kiếm tại địa phương nơi nhà máy đang hoạt động.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 3
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV
-
thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.
Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn; dễ dàng
-
tách sản phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV giống.
Giống phải ổn định trong bảo quản và dể dàng bảo quản.
-
Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình lên
men công nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần khiết.
2.1.3. Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Aspergillus oryzae
Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes
( nang khuẩn ). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất
mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi
thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào ). Từ những sợi nằm ngang này hình thành
những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính.
Cuống đính bào tử của Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng
mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này
phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 4
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính
bào tử. Đính bào tử của Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…
Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại
bào ( amylase, protease, pectinasa,… ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên
liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch,
ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi
thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các
bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ
mọc thành mốc mới.
2.1.4. Quá trình phân lập giống VSV.
VSV phân bố rất rộng trong tự nhiên từ nơi có địa hình bình thường đến nơi có
địa thế phức tạp, đâu đâu cũng có mặt VSV.Ở những nơi giàu chất hữu cơ,
những nơi nghèo chất hữu cơ, trong không khí, trên bề mặt các vật, trong cơ thế
người, động vật, nơi có nhiệt độ rất thấp và hiện diện cả ở nơi có nhiệt độ cao.
VSV có khả năng thích nghi trong mọi hoàn cảnh môi trường. Chính nhờ khả
năng tuyệt vời này mà VSV có khả năng tồn tại ngay cả trong hoàn cảnh khắc
nghiệt nhất.
Thông thường để phân lập một giống chủng VSV để thu nhận enzyme thì có 3
cách phân lập:
+ Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
+ Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
+ Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 5
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
Tùy thuộc vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách phân lập
cho phù hợp nhất. Mỗi cách phân lập trên đều cho thấy những ưu điểm riêng
biệt. Sau đây là 1 số ưu điểm:
a. Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên.
Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi nhanh được thì
cần phải có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme để chuyển hóa
nhanh cơ chất có trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế bào. Điều này
thì không thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme ( ở quy mô sản xuất công
nghiệp ) với một loại enzyme thật sự mạnh.
Do phát triển trong điều kiện tự nhiên, VSV phải cùng lúc đối phó với hàng loạt
các yếu tố ngoại cảnh và phải phân giải rất nhiều loại cơ chất khác nên VSV
bắt buộc phải tổng hợp nhiều loại enzyme với một nỗ lực rất lớn.
Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác
biệt đáng kể các giống VSV có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện
tự nhiên, được gọi chung là các chủng VSV hoang dại. Chúng đã quá quen thuộc
với sự thay đổi thất thường của điều kiện tự nhiên. Khi chúng ta đưa chúng vào
điều kiện sản xuất công nghiệp với nhiều điều kiện môi trường cố định, đòi hỏi
các loài VSV giống phải có một thời gian thích nghi với điều kiện sản xuất công
nghiệp. Huấn luyện chúng thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp là
điều rất cần thiết.
Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó thường tập
trung ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng. Dựa và đặc điểm này
để chúng ta có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loại VSV sinh tổng hợp
enzyme mà ta cần.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 6
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
Ví dụ: Nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp amylase cao, ta
phải tìm nơi có chứa nhiều tinh bột trong tự nhiên, còn nếu muốn phân lập VSV
có khả năng sinh tổng hợp protease ta cần phải tìm nơi có chứ nhiều protein
trong tự nhiên.
Trong quá trình sinh sản và phát triển, cạnh tranh giữa các loài VSV, VSV trong
điều kiện tự nhiên luôn xảy ra những thường biến và đột biến. Những đột biến
thường cho ra hai hiệu ứng: Thứ nhất gây cho cá thể chết; thứ hai là nhiều đột
biến tạo ra loài mới có khả năng sinh tổng hợp enzyme rất cao. Việc tìm ra
những đột biến kiểu này thì hết sức có ý nghĩa và rất cần tiến hành. Và một lợi
điểm nữa là, những đột biến có lợi kiểu này thường rất bền vững. Rất thích hợp
để đưa vào sản xuất ở qui mô công nghiệp.
b. Phân lập giống trong điều kiện sản xuất.
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều
kiện sản xuất. Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cần qua giai đoạn
sản xuất thử, thí nghiệm.
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những giống đã
được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặc điểm sinh
hoá hơn hẳn các giống vi sinh vật hoang dại.
Mật độ tế bào vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên men, dịch
nước thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao. Do đó, khả năng thu
nhận được những chủng có bản năng sinh tổng hợp cao thường rất cao.
c. Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng.
Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm, có thể rất
nhiều tế bào VSV giống bị thoái hoá, nhưng cũng còn nhiều tế bào không bị
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 7
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
thoái hoá. Việc phân lập lại từ nguồn giống này nhiều khi lại đạt được những
kết quả tốt.
2.2. Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus Oryzae
Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease.
Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme
protease này là protein. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có thể mua
trực tiếp từ cung cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này là giống mua thì
thời gian bảo quản và hiệu suất chất lượng giống được đảm bảo chắc chắn.
Tuy nhiên, quá trình phân lập giống này có thể cho những kết quả đầy thú vị và
có ý nghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới tại phòng thí nghiệm.
Quá trình lấy mẫu: Có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát
đem chôn xuống đất. Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra,
rủ sạch cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây. Sau đó cho vào bao nyclon và
mang về phòng thí nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm phân lập:
Nghiền mẫu đối với những mẫu khoai tây.
Lấy 10g mẫu đất hoặc mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước cất
vô trùng sau đó đảo trộn mẫu.
Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyển sang 1 ông nghiệm khác
có chứa 90ml nước cất vô trùng.
Tiếp tục pha loãng mẫu ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo.
Hút 0,1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm
mốc phát triển,môi trường PDA (Potato Dextro Agar).
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 8
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt
độ phòng trong vòng 3 ngày.
Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ xuất hiện
những quầng sáng xung quanh khuẩn lạc.
Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy. Có tác
dụng là chất chỉ thị cho tinh bột.
Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống thạch
nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể dự
trữ trong máy làm đông.
Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (qui mô nhỏ).
Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm.
Lắc đều cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù.
Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môi
trường sinh trưởng của nấm.
KH2PO4 1,4 MgSO4.7H2O 0,1
NH4NO3 10 FeSO4.7H2O 0,01 PH = 6,5
hồ tinh bột
KCl 0,5 20
Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởi
Autoclave ở 1210C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó
đem ủ ở 25 – 300C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau khi nhân
giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ, để có
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 9
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
hiệu quả cao cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo quản thích
hợp.
III: CÔNG NGHỆ LÊN MEN TẠO ENZYME PROTEASE
3.1. Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt
Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy VSV thường được thực hiện theo
phương pháp bề mặt. Phương pháp này được phát triển rất rộng rãi, không chỉ
để thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng
sinh và một số quá trình lên men truyền thống.
3.1.1. Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho VSV phát triển
trên bề mặt môi trường. Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là:
- Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện. Quy trình công nghệ thường
không phức tạp.
- Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn
rất nhiều so với nuôi cấy chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng
trong giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát
triển mạnh trở lại.
- Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối
VSV, enzyme và nước ). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo
quản.
- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó
việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa
không tốn kém.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 10
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
- Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi
trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị
nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy.
Những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt cũng có những ưu điểm cần quan tâm để khắc
phục và hoàn thiện dần phương pháp này. Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận
thấy nhất đó là: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong
phương pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường ( môi trường lỏng hoặc
môi trường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích.
a. Môi trường lỏng.
Ở môi trườn lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn
lạc ngăn cách pha lỏng ( môi trường ) và pha khí ( không khí ). Ở đây, VSV sẽ sử
dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O2 từ không khí, tiến hành quá
trình tổng hợp enzyme. Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan
vào dung dịch môi trường. Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV.
Nuôi cấy VSV thu nhận enzyme trên môi trường lỏng theo phương pháp cấy bề
mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15 cm, chiều
rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận
tiện trong thao tác.
Ở đây người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu chiều cao
môi trường lỏng quá lớn, VSV sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất dinh
dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi trường nhỏ, sẽ thiếu thành
phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme sẽ không cao.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 11
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
Trong nghiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong kháy nuôi cấy có
chiều cao môi trường từ 5-7 cm là hợp lý.
b.Môi trường đặc.
Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme,
người ta thường sử dụng môi trường đặc. Để tăng khả năng xâm nhập của
không khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt
ngũ cốc để làm môi trường.
Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh
dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Các
enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme
nội bào nằm trong sinh khối VSV.
VSV không chỉ phá triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn ( môi
trường ) và pha khí ( không khí ) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi
trường nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao
và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại ,
không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu có độ ẩm thấp
quá sẽ không thuận lợi cho VSV phát triển. Thông thường người ta thường tạo
độ ẩm khoảng 55-65% W là hợp lý.
Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấu VSV thu nhận enzyme,
người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện
thuận lợi không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường. Phương pháp nuôi cấy
bề mặt bán rắn(môi trường đặc ) này rất thích hợp cho len men ở nấm mốc
Asp.oryzae.
3.2. Sản xuất nấm mốc giống – nuôi cấy tạo sinh khối.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 12
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
3.2.1. Môi trường cho sản xuất mốc giống:
dùng môi trường tổng hợp
Môi trường Benhamin.
Bột ngô 20g
Glucose 10g
Pepton 10g
Cao Nấm men 4g
Nước 1000ml
3.2.2. Chuẩn bị mốc giống.
Nuôi cấy giồng bao gồm:
Trong ống thạch nghiêng hay giữ giống trong ống nghiệm.
Trong bình tam giác (nhân giống nhỏ).
Trên sàng, khay (nhân giống lớn).
3.2.3. Nuôi cấy tạo sinh khối .
Sau khi phân lập thành công trên môi trường chọn lọc từ đĩa petri cấy chuyển
những mốc sợi sang (hay lấy nấm mốc từ ống giống) ống thạch khác. Yêu cầu
ống giống phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết, không được lẫn lộn bất kỳ một
loài VSV nào khác.Môi trường thạch nghiêng phải đảm bảo đầy đủ dinh dưỡng.
Tiếp tục nhân giống và nuôi cấy cho đến khi đạt được sinh khối theo mong
muốn.
3.3. Thu nhận enzym protease từ nấm mốc Aspergillus Oryzae.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 13
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
3.3.1. Sinh trưởng và sinh tổng hợp protease từ nấm.
Khi nuôi VSV tạo protease có 2 quá trình liên quan mật thiết với nhau. Quá trình
tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hoặc ngoài môi
trường.
Ở một số VSV, quá trình sinh tổng hợp protease tiến hành song song với quá
trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng
khối. Trong trcấy ng hợp này, sinh tổng hợp enzyme protease kết thúc ở pha logarit
Nuôi ườ
cùng đồng thời với sự ngưng sinh trưởng và sự bắt đầu pha phát triển ổn định
Chế phẩm ezyme thô
Thu nhận phế phẩm
tiếp theo sau. thô đem sử dụng
enzyme
Tuy nhiên theo ý kiến của nhiều tác giả, sự tạo thành protease cực đại thường
Chế phẩm enzyme thô
xảy ra sau khi chế n thể
đem tinh quầ tế bào VSV đạt điểm sinh trưởng. Trong trường hợp
này, sinh trưởng của VSV hầu như không kèm theo sự tích lũy enzyme protease
trong canh trền mịn chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự tổng hợp
Nghi ường,
enzyme cực lớn.
Trích ly
3.3.2.Qui trình thu nhận enzyme protease.
Dùng trong chăn nuôi
Lọc Bã
Cồn hoặc Sulfat
Kết tủa enzyme amon
Thu nhận kết tủa
Sử dụng chế phẩm
ezyme tinh sạch
Sấy kế tủa
Tinh chế kết tủa
Thu nhận chế phẩm
enzyme tinh khiết
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 14
Enzyme tinh khiết
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 15
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
Thuyết minh qui trình:
Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay
với chiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ.
Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường
xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không
khí.Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28-320C. Nhiệt độ thấp quá
hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển.
Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường bán
rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng
đến toàn bộ khối môi trường.
Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn
phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường cũng như
phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng
phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy.
Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:
-Nhiệt độ tăng rất chậm.
-Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.
-Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.
-Khối môi trường còn rời rạc.
-Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 16
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối
không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm
với nhiệt độ.
Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay
đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu
phát triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp
trong các hạt môi trường trong lòng môi trường.
- Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám
bằng mắt thường.
- Môi trường được kết lại khá chặt.
- Độ ẩm môi trường giảm dần.
- Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-450C.
- Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi.
- Enzym protease được tổng hợp mạnh.
-Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này
cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-
300C là tốt nhất.
Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay
đổi cơ bản như sau:
-Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm
lại.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 17
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
-Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi
trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ
nuôi duy trì ở 300C,trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó
lượng Enzym protease tạo ra sẽ giảm xuống. Chính vì thế việc xác định thời
điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết.
Thu nhận sản phẩm:
Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzym protease, chế
phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thô (vì ngoài thành phần enzym ra, chúng
còn chứa sinh khối VSV, thành phần môi trường và nước trong môi trường).
Để đảm bảo cho chế phẩm enzym protease không bị mất hoạt tính nhanh người
ta thường sấy khô chế phẩm enzym đến một độ ẩm thấp ( thiết bị sấy thường
dùng ở đây là máy sấy chân không- có thể xem ở phần phụ lục). Độ ẩm cần đạt
được sau khi qúa trình sấy kết thúc là nhỏ hơn10% độ ẩm. Để đảm bảo hoạt
tính enzym không thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38-400C. Enzym
protease ở nấm mốc Asp.oryzae sẽ bị bất hoạt nếu nhiệt độ lên đến 60-70 độ C.
Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần
phải quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến
hành làm sạch enzym. Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành như
sau:
Toàn bộ khối lượng enzym thô protease được đem đi nghiền nhỏ.Mục đích của
qúa trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của
chế phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ ,các enzym nội bào chưa thoát ra
khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào. Phần lớn enzym protease ngoại bào
khi được tổng hợp và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi
trường. Khi ta nghiền nhỏ, enzym thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 18
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong trường
hợp này đượcdùng là cát thạch anh và bột thủy tinh. Các chất này là những chất
vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi
sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ
lớn hơn 100oC để loại bỏ nước và tiêu diệt VSV.
Trích ly:
Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzym protease. Các loại
enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng nước
như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzym thô, người ta cho 4-5
phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực
phẩm gia súc ( chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp
bã rồi mới cho gia súc ăn).
Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa nước,
các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm sao tách
enzym ra khỏi vật chất này.
Quá trình kết tủa enzym protease:
Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzym nhờ những tác nhân gây
tủa.Trong công nghệ tinh chế enzym, người ta thường dùng cồn và sunfat amon.
Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa
khác.
Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và
cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzym. Khi đổ chất làm
kết tủa enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng
biến tính.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 19
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
Trong qúa trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulfat amon với liều lượng như
sau: Cứ một phần dung dịch enzym thô người ta cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc
sulfat amon.
Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzym thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ,
sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-7 OC) theo thời gian,
các enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc
thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W).
Ở trạng thái này enzym rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản
người ta sấy kết tủa enzyn protease ở 40OC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-
8% W ( thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương – có thể xem ở phần
phụ lục).
Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzym protease ở dạng kết tủa vẫn hoàn
toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đố còn chứa 1 số enzym ngoài enzym ta
quan tâm.
II.Kết luận
Tóm lại, có thể nói rằng, việc nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm enzyme ngày
càng được chú trọng ở các lĩnh vực khác nhau. Trong 20 năm cuối thế kỷ XX và
các năm đầu của thế kỷ XXI các enzyme khác nhau đã được ứng dụng. Ở Việt
Nam bước đầu đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các enzyme trong chế biến
nông sản, thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh
bột (Viện công nghiệp thực phẩm, Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực
phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội…). Việc nghiên cứu các enzyme phục vụ
nông nghiệp, công nghiệp cũng được quan tâm và có các kết quả đáng khích lệ.
Ví dụ, chế phẩm enzyme mới ra đời phục vụ nông nghiệp E2001 có tác dụng
tăng độ phì nhiêu đất, tăng năng suất cây trồng. Đã có các nghiên cứu ứng dụng
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 20