QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ

Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm,đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật,nguy cơ hư hỏng ,thời hạn bảo quản của sản phẩm,mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm

Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C BÀI 1:QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 1.Định nghĩa: Vi sinh vật hiếu khí là vi sinh vật tăng trưởng và hình thành trong điều kiện có oxy phân tử 2.Ý nghĩa của việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí: Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm,đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật,nguy cơ hư hỏng ,thời hạn bảo quản của sản phẩm,mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm Sự tăng trưởng vi sinh vật trong thực phẩm dẫn đến biến đổi chất lượng : 106 tế bào/g(ml) là ranh giới để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư hỏng hay không.Một vài trường hợp vsv=106 tế bào/g(ml) chưa có dấu hiệu hư hỏng rõ ràng về mặt hóa học.Đặc biệt ở sữa khi có 105 tế bào/g(ml) sữa bị chua: 106-107tế bào/g(ml) sữa có mùi hôi;108 tế bào/g(ml) tất cả thực phẩm có mùi hôi không chấp nhận được;109-1010tế bào/g(ml) thực phẩm thay đổi cấu trúc 3.Quy trình kiểm tra: Trang 1 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 1ml(10-1)+ 9ml nước 1ml(10-1)+ 9ml nước nước vô trung ̀ nước vô trung ̀ Stomacher .10gr thưc phâm ̣ ̉ 10-2 10-3 + 90ml NaCl 0.85% (10-1) Bước 1: đồng nhất mẫu Cho 10 g thực phẩm vào 90 ml NaCl 0.85% vô trùng(hoặc H20 vô trùng )vào bao PE vô trùng.Tiến hành đồng nhất bằng máy stomacher 30” thu được nồng độ 10-1 Bước 2 : pha loãng mẫu Chuẩn bị các ống nghiệm và pipet vô trùng.Dùng pipet 10ml vô trùng lấy 9 ml NaCl vô trùng vào các ống nghiệm .Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml từ nồng độ 10-1 đưa vào ống nghiệm thứ nhất . Tiến hành rung lắc ống nghiệm bằng máy rung ống nghiệm votex, thu được nồng độ 10-2 .Làm tương tự với các nồng độ kế tiếp Lưu ý khi pha loãng mẫu: Trang 2 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C -Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh của thực phẩm,thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản,kinh nghiệm người kiểm nghiệm…. -Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn.Các ống nghiệm,pipet phải vô trùng.Sử dụng 1 micropipet 1ml/ 1 nồng độ pha loãng mẫu để tránh hiện tượng sai số -Mỗi lần lấy mẫu phải lắc đều Bước 3: nuôi cấy dịch mẫu Nuôi cấy ít nhất ở 3 nồng độ pha loãng mẫu liên tiếp Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml dịch mẫu cho vào đĩa,ít nhất 2 đĩa/nồng độ Chuẩn bị môi trường đã tiệt trùng,để nguội 450C,đổ môi trường vào các đĩa đã chứa 1ml dịch mẫu .Xoay nhẹ đĩa theo vòng tròn nhằm trộn đều dịch mẫu với môi trường để thu được những khuẩn lạc tách rời.Khi môi trường đông lại,lật ngược đĩa,ủ trong trong tủ ổn nhiệt Memmert Nếu muốn kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí,dùng môi trường P.C.A hoặc N.A Nếu muốn kiểm tra tổng số men, mốc dùng môi trương P.D.A hoặc Sabouraund Thời gian ủ vi khuẩn hiếu khí 24-48h/30-370C.Thời gian ủ men,mốc 72h/30-370C Bước 4: đếm số khuẩn lạc /đĩa/các nồng độ(25-250 khuẩn lạc/đĩa) Kết quả thí nghiệm 10-1 10-2 10-3 Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 1 Đĩa 2 Nồng độ Số khuẩn 48 130 113 125 105 120 lạ c Trang 3 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Bước 5: tính kết quả theo công thức n = c/(n1+0.1n2)*d n : tổng số tế bào / ml (g) mẫu thực phẩm(cfu/g(ml)) c : tổng số khuẩn lạc đếm được n1 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư nhất n2 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư hai d : nồng độ pha loãng thứ nhất được đếm (113 + 125 + 105 + 120).100 =21045 ≈ 21000 cfu/g(ml) =>n= (2 + 0,1.2) 4.Môi trường sử dụng 4.1.Môi trường Nutrient Agar Peptone :5.0g Meat extract :3.0g Agar :12.0g Nước cất :1000ml pH sau thanh trùng : 7.0 ± 0.2 Hấp thanh trùng ở 1210C/15 phút 4.2.Môi trường Plate Count agar Peptone :5.0g Meat extract :2.5g D(+) glucose :1.0g Agar :14.0g Nước cất vừa đủ :1000ml pH sau thanh trùng : 7.0 ± 0.2 Hấp thanh trùng ở 1210C/15 phút 4.3.Môi trường Sabouraund Trang 4 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Peptone :20g Glucose :40g Agar :20g Nước :1000ml Hấp thanh trùng ở 1210C/15 phút BAI 2: KIÊM TRA TÔNG SỐ COLIFORM ̀ ̉ ̉ 1.Những kiến thức chung về COLIFORM Coliform là nhom trực khuân gram- , không bao tử , hiêu khí hoăc kị ́ ̉ ̀ ́ ̣ khí tuy y, có khả năng lên men đường lactose, sinh hơi ở 37oC /24 – 48h. ̀́ Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhom vi sinh vât dung ́ ̣ ̀ để chỉ thị khả năng có sự hiên diên cua cac vi sinh vât gây bênh trong thực ̣ ̣ ̉ ́ ̣ ̣ phâm. Nhom coliform gôm những vi sinh vât hiêu khí và kị khí tuy y, gram ̉ ́ ̀ ̣ ́ ̀́ - , không bao tử , hinh que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môi ̀ ̀ trường long, dựa vao nhiêt dộ tăng trưởng, nhom nay được chia thanh 2 ̉ ̀ ̣ ́ ̀ ̀ nhom nhỏ là coliform và coliform phân có nguôn gôc từ phân cac loai đông ́ ̀ ́ ́ ̀ ̣ vât. Trên thực tế kiêm nghiêm coliform phân được quan tâm nhiêu hơn ̣ ̉ ̣ ̀ coliform. Coliform phân có nguôn gôc từ ruôt người và cac đông vât mau ̀ ́ ̣ ́ ̣ ̣ ́ ́ ̀ ́ ́ nong bao gôm cac giông escherichia, kebsiella, enterobater. Khi coliform phân hiên diên ở môt số lượng lớn trong mâu thì mâu có khả năng chứa cac ̣ ̣ ̣ ̃ ̃ ́ vi sinh vât gây bênh hiên diên trong phân.Chỉ tiêu tổng coliform không thích ̣ ̣ ̣ ̣ hợp để làm chỉ tiêu chỉ thị cho việc nhiễm bẩn nguồn nước bởi phân. Tuy nhiên việc xác định số lượng Feacal coliform có thể sai lệch do có một số vi sinh vật (không có nguồn gốc từ phân) có thể phát triển ở nhiệt độ 44oC. Do đó số lượng E. coli được coi là một chỉ tiêu thích hợp nhất cho việc quản lý nguồn nước. Trong cac thanh viên nhom coliform phân thì E.coli là loai được ́ ̀ ́ ̀ quan tâm nhiêu về vệ sinh an toan thực phâm. ̀ ̀ ̉ Trang 5 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Loai vi sinh vât nay phân bố ở moi nơi, có trong ruôt người và cac ̀ ̣ ̀ ̣ ̣ ́ ̣ ̣ ́ ́ đông vât mau nong. *môt số hinh anh về coliform: ̣ ̀ ̉ Fecal Coliform 375 x 294 Chromocult® Coliform Agar ES 297 x 300 Trang 6 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 2.Ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu Coliform được xem là nhom vi sinh vât chỉ thi. Số lượng hiên diên ́ ̣ ̣ ̣ ̣ cua chung trong thực phâm, nước được dung để chỉ thị cho khả năng hiên ̉ ́ ̉ ̀ ̣ diên cua cac vi sinh vât gây bênh khac. Số lượng coliforms cao thì khả ̣ ̉ ́ ̣ ̣ ́ ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ ́ năng hiên diên cua vi sinh vât gây bênh khac cao. ̣ ̣ Colifrorm chiu nhiêt( coliform phân): • Là thanh phân trong hệ vi sinh vât đường ruôt ở người và cac ̀ ̀ ̣ ̣ ́ ̣ ̣ ́ ́ đông vât mau nong. • Được xem là vi sinh vât chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trinh ̣ ̀ chế biên, bao quan , vân chuyên thực phâm, nước uông cung như chỉ ́ ̉ ̉ ̣ ̉ ̉ ́ ̃ thị sự ô nhiêm phân trong môi trường. ̃ Lên men đường lactose trong môi trường E.C ở 44.5oC. • Có khả năng sinh indol 24h/44.5oC. • Kêt quả sinh hoa nghiêm phap imvic là + + - - ́ ́ ̣ ́ • 3.Quy trình kiểm tra Phương phap MPN : ́ ́ Nguyên tăc: Mâu được pha loang thanh môt day thâp phân , 2 nông độ kế tiêp ̃ ̃ ̀ ̣ ̃ ̣ ̀ ́ nhau khac nhau 10 lân. Mâu được ủ trong môi trường thich hợp có ông ́ ̀ ̃ ́ ́ durham. Môi nông độ pha loang được lăp lai 3 ông. Theo doi sự sinh hơi ̃ ̀ ̃ ̣ ̣ ́ ̃ trong từng ông nghiêm. Xac đinh ông dương tinh ở môi nông độ pha loang ́ ̣ ́ ̣ ́ ́ ̃ ̀ ̃ và dựa vao bang MPN để suy ra số lượng nhom vi sinh vât tương ứng hiên ̀ ̉ ́ ̣ ̣ ̣ ̣ ̃ ̀ diên trong 1g hoăc 1ml mâu ban đâu Sơ đồ quy trình kiểm tra : Trang 7 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 1ml(10-1)+ 9ml nước 1ml(10-2)+ 9ml nước vô trung ̀ nước vô trung ̀ Stomacher 10gr thực phâm ̉ 10-2 10-3 + 90ml NaCl 0.85%( 10-1 ) ̀ hinh 1.1 Bước 1: Trang 8 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 10gr thực phâm + 90ml NaCl 0.85% hoăc là nước vô trung, ̉ ̣ ̀ stomacher thu được nông độ 10-1. muc đich đông nhât là để phân bố đêu vi ̀ ̣ ́ ̀ ́ ̀ ̣ sinh vât. Bước 2: Pha loang mâu để giam số lượng vi sinh vât có trong mâu ban dâu. ̃ ̃ ̉ ̣ ̃ ̀ Lây 1ml mâu ở nông độ 10-1 cho vao ông nghiêm thứ nhât, sau đó cho 9ml ́ ̃ ̀ ̀́ ̣ ́ nước vô trung. Ta được ông nghiêm có nông độ 10 -2. Sau đó lây 1ml mâu ở ̀ ́ ̣ ̀ ́ ̃ nông 10-2 cho vao ông nghiêm thứ hai + 9ml nước vô trung thu được ông ̀ ̀́ ̣ ̀ ́ nghiêm có nông độ 10-3 . tương tự như trên ta thu được cac ông nghiêm có ̣ ̀ ́́ ̣ nông độ 10-4, 10-5….. ̀ Bước 3: Nuôi cây dich mâu trong môi trường Laury Tryptose (LT) ở 3 nông ́ ̣ ̃ ̀ độ liên tiêp(10-1,10-2,10-3) như sau : Môi nông độ lây 3 ông nghiêm. Cho vao ́ ̃ ̀ ́ ́ ̣ ̀ môi ông nghiệm 1 ông durham, cho môi trường LT vao 9 ông nghiêm sao ̃́ ́ ̀ ́ ̣ cho ngâp ông durham. Ghi 3 nông độ liên tiêp bên ngoai ông nghiêm(môi ̣́ ̀ ́ ̀́ ̣ ̃ nông độ 3 ông nghiêm). Tiêp đên cho 1ml dung dich mâu ở nông độ 10 -1 ̀ ́ ̣ ́ ́ ̣ ̃ ̀ vao 3 ông nghiêm có ghi nông độ 10-1(chứa môi trường LT),tương tự cho ̀ ́ ̣ ̀ cac ông nghiêm ở những nông độ tiêp theo. (hinh 1.1) ủ ở 37oC/24h ́́ ̣ ̀ ́ ̀ Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose (LT): -Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn. - Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Laury Trytose. - Không lắc những ống có ống durham Bước 4: Đoc kêt quả cac ông Laury Tryptose . Có 3 trường hợp xay ra: ̣ ́ ́́ ̉ Trang 9 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C ́ ̉ + ông durham không thay đôi ́ ̉ + ông durham nôi lên trên + ông durham sinh hơi. ́ Đoc kêt quả cac ông LT dương tinh, sau đó cây chuyên cac ông LT ̣ ́ ́́ ́ ́ ̀ ́́ dương tinh nay vao cac ông môi trường BGBL 2% băng cach lây que cây ́ ̀ ̀ ́́ ̀ ́ ́ ́ vong nhung vao môi trường LT dương tinh ở trên,rồi cho vao ông có môi ̀ ́ ̀ ́ ̀́ trường BGBL. Ghi nông độ trên san phâm. Ủ 37oC /24h. ̀ ̉ ̉ Ông LT + : môi trường đuc và ông durham ( ông chuông) nôi hoăc có ́ ̣ ́ ́ ̉ ̣ bot khí trong ông chuông (thể tich bot khí trong ông chuông =1/10 thể tich ̣ ́ ́ ̣ ́ ́ ́ ông chuông). Ông LT - : không có hiên tượng gì xay ra ́ ̣ ̉ Bước 5: Đoc kêt quả ông BGBL dương tinh. Lâp tỷ lệ cac ông BGBL dương ̣ ́ ́ ́ ̣ ́́ tinh ở 3 nông độ liên tiêp. Tra bang Mac Crady tim số MPN tương ứng ́ ̀ ́ ̉ ̀ + ông BGBL dương tinh: môi trường đuc và ông durham ( ông chuông) ́ ́ ̣ ́ ́ nôi hoăc có bot khí trong ông chuông( thể tich bot khí =1/10 thể tich ông ̉ ̣ ̣ ́ ́ ̣ ́ ́ chuông). + ông BGBL âm tinh: không có hiên tượng gì xay ra. ́ ́ ̣ ̉ Bước 6: ́ ́ ̉ Tinh kêt qua: Tông số coliform (cfu/g hoăc cfu/ml)= số MPN × 10n ̉ ̣ n là số nguyên dương cua nông độ pha loang đâu tiên được nuôi cây. ̉ ̀ ̃ ̀ ́ Bước 7: Từ kêt quả tinh được, so sanh với tiêu chuân về an toan vệ sinh thực ́ ́ ́ ̉ ̀ ̉ phâm. 4. Môi trường sử dụng: Trang 10 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Môi trường BGBL 2% : là môi trường dung để phat hiên và đêm ̀ ́ ̣ ́ coliforms, coliforms phân, E.coli trong sữa, thực phâm, nước. ̉ ́ Nguyên tăc: Mât bò ( bile) và brilliant green ức chế hâu hêt cac vi khuân gram + và ̣ ̀ ́́ ̉ ̉ không phai coliform. Brilliant green có nông độ đăc hiêu ̉ ̀ ̣ ̣ – vi khuân gram nhăm ngăn vi khuân kị khí lên men lactose sinh trưởng ở 440C , Tranh được ̀ ̉ ́ hiên tượng dương gia, luc nay coliform phat triên lam đuc môi trường và ̣ ̉́ ̀ ́ ̉ ̀ ̣ sinh khí trong ông durham do lên men lactose. ́ 5.Các thiết bị ,dụng cụ sử cho thí nghiệm Binh erlen, đen côn, que cây vong, ông nghiêm ,nôi autoclave, tủ sây, ̀ ̀ ̀ ́ ̀ ́ ̣ ̀ ́ ông durham , micropipet, mâu là tương ớt. ́ ̃ 6.Kết quả thí nghiệm _ _ _ 10-1 + + _ Trang 11 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 10-2 _ _ _ 10-3 Tỷ lệ cua BGBL dương tinh ở 3 nông độ (10 -1:10-2:10-3) = (0,2,0) ̉ ́ ̀ Tra bang Mac Crady ta được số MPN =6.2N/g ̉ ∑ coliform = 6.2 × 101=62 (cfu/ml) BÀI 3: KIỂM TRA TỔNG SỐ E.COLI Escherichia coli là dạng coliform có nguồn gốc từ phân, phát triển được ở 44ºC, sinh indol (phản ứng ind+), sinh acid (phản ứng MR+), không sinh aceton (phản ứng V.P-) và không sử dụng citrate làm nguồn cacbon (phản ứng cit-).Là trực khuẩn gram-, có khả năng gây bệnh tiêu chảy và sinh nội độc tố.Được coi là vi sinh vật chỉ thị cho sự nhiễm phân và chất lượng vệ sinh thực phẩm. Các chủng E.coli có khả năng gây bệnh ở người : - Các chủng truyền thống gây tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ em. Các chủng yếm khí không bắt buộc gây tiêu chảy không thường - xuyên có quan hệ gần gũi với hệ vi sinh vật bình thường ở đường ruột. - Các chủng sinh độc tố bền hoặc không bền với nhiệt hoặc cả hai. Trang 12 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C - Các chủng gây lây nhiễm đường ruột. 1.Mục đích thí nghiệm: Xác định E.coli trong mẫu thực phẩm. Ở đây, nhóm tiến hành kiểm tra tổng số E.coli trên mẫu tương ớt. 2. Nguyên tắc: mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân, hai nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ống durham. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3-5 ống. Theo dõi sự sinh hơi trong từng ống nghiệm. Xác định các ống dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g hoặc 1ml mẫu ban đầu. 3.Dụng cụ và hóa chất: 3.1.Thiết bị và vật liệu: - Tủ ấm - Bể điều nhiệt - Máy lắc - Cân - Pipet tiệt trùng - Các bình chứa mẫu vô khuẩn - Các lọ phục vụ cho mực đích pha loãng, có nút đậy - Mẫu thực phẩm kiểm tra - Ống durham Trang 13 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 3.2.Môi trường và hóa chất: - Môi trường E.C broth - Môi trường Lauryl tryptose( LT) - Môi trường endo agar Môi trường E.M.B agar (eosin methylene – blue lactose sucrose agar). - - Môi trường N.A (nutrient agar) 4.Tiến hành thí nghiệm: Bước 1: Lấy mẫu Tùy loại vật phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu với số lượng và khối lượng khác nhau cho phù hợp. Khi lấy mẫu cần đảm bảo : - Mẫu phải có tính đại diện. - Lượng mẫu vừa phải, đủ để phân tích các đặc tính lý hóa,sinh học. - Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô khuẩn. - Mẫu lấy xong phải phân tích ngay không để quá 24 giờ. - Mẫu phải có nhãn ghi kí hiệu, ghi lại những đặc điểm của mẫu và nơi thu mẫu. Lấy 10g tương ớt + 90ml NaCl 0.85%, stomacher thu được nồng độ 10-1 Bước 2: Pha loãng mẫu Sơ đồ tiến hành pha loãng mẫu lỏng: 10ml 1ml 1ml 1ml Trang 14 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Mẫu 10-2 10-3 10-4 90ml NaCl vô trùng 10-1 9ml NaCl 9ml NaCl 9ml NaCl (nước vô trùng) vô trùng vô trùng vô trùng Trang 15 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Sơ đồ tiến hành pha loãng mẫu rắn: 1ml 10ml 1ml 1ml 10g mẫu Stomacher 10-2 10-3 10-4 90ml NaCl vô trùng 10-1 9ml NaCl 9ml NaCl 9ml NaCl (nước vô trùng) vô trùng vô trùng vô trùng Tiến hành tương tự cho các mẫu pha loãng khác Những điều lưu ý khi pha loãng mẫu: - Khi pha loãng mẫu nên dùng nước muối vô trùng nhằm tạo môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật, nếu chỉ dùng nước cất vô Trang 16 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C trùng vi sinh vậy sẽ chết khi để lâu bên ngoài mà không có môi trường dinh dưỡng. - Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn. Các dụng cụ phải được vô trùng. - Khuấy trộn đều dung dịch mẫu trước khi pha loãng để vi sinh vật phân tán đều trong mẫu. - Tế bào ở các độ pha loãng khác nhau cần được lấy với các pipet khác nhau nhằm tránh các tế bào ở độ pha loãng trước lẫn với các tế bào ở độ pha loãng sau. - Nồng độ pha loãng còn phụ thuộc: • Đặc điểm của thực phẩm(thời hạn sử dụng, điều kiện bảo quản, quy trình chế biến...). • Người kiểm phẩm ( kinh nghiệm, thao tác....). Bước 3 : Nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose ( LT) Tiến hành nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Trytose ở 3 nồng độ liên tiếp, 3 ống/ nồng độ, 1ml dịch pha loãng/ ống LT. Ủ 37ºC/24h. 10-2 10-3 10-4 Trang 17 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Môi trường Laury Trytose( LT) Rồi để yên cho thạch đông lại, đem đĩa ủ trong tủ ấm. Ủ ở 37oC trong 24h Sau khoảng thời gian trên lấy đĩa đã ủ ra và đếm khuẩn lạc, tính kết quả. Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose (LT): - Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn. - Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Laury Trytose. - Không lắc những ống có ống durham Bước 4 : Đọc kết quả các ống Laury Tryptose dương tính( +), cấy chuyền các ống LT(+) vào các ống môi trường E.C. Ủ 44ºC/24h. E.coli phát triển ở 44ºC,ở nhiệt độ này một số vi khuẩn khác đã bị hạn chế khả năng sinh trưởng .Hơn nữa môi trường E.C muối mật ức chế cá vi khuẩn Gr + và các vi khuẩn không thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột Trang 18 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Ông LT + : môi trường đuc và ông durham ( ông chuông) nôi hoăc có ́ ̣ ́ ́ ̉ ̣ bot khí trong ông chuông (thể tich bot khí trong ông chuông =1/10 thể tich ̣ ́ ́ ̣ ́ ́ ́ ông chuông). Ông LT - : không có hiên tượng gì xay ra ́ ̣ ̉ Từ các ống E.C (+), cấy phân lập trên môi trường endo agar và E.M.B agar. Ủ 37ºC/24h Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường endo agar và E.M.B agar: • Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn. Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành phân lập vi khuẩn • trên môi trường endo agar và E.M.B agar Sau khoảng thời gian trên lấy ra đem nhận diện khuẩn lạc điển hình: - Môi trường endo agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có ánh kim loại - Môi trường E.M.B agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có tâm đen, có ánh kim. Bước 5 : Từ các khuẩn lạc nghi ngờ, cấy truyền sang môi trường N.A. Ủ 37ºC/24h. Buớc 6 : làm nghiệm pháp imvic với vi khuẩn đã cấy ở bước 5 I : indol M :methyl red V : V.P C : simon citrat Phản ứng sinh hóa kiểm tra sự có mặt của trực khuẩn đường ruột Gr– có khả năng sử dụng simon citrat Trang 19 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Kết quả : + + - - : E.coli type I - + - - : E.coli type II BÀI:4 KIỂM TRA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS 1. Đặc điểm của Stapylococcus aureus: 1.1. lịch sử: Staphylococcus được Ogston phát hiện năm 1881 trong vết thương có mủ.Năm 1884, Rosenbach tiếp tục nghiên cứu. 1.2. Phân bố: Được phân bố rộng rãi, có nhiều trong sản phẩm động vật như • thịt, sữa… Ở người thường có trên da, tóc, khoang mũi. • Bị lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm bệnh. • Được xếp vào nhóm vi khuẩn cơ hội(opportunist type) vì sự có • mặt rộng rãi và thường xuyên trong mô và chờ đợi điều kiện thuận lợi để xâm nhập. 1.3. Hình dạng tế bào: Là vk gram+, hình cầu không bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ ý. Trong vết thương và máu thường thấy hình dạng giống chùm nho 1.4. Đặc điểm và điều kiện sinh trưởng: Phát triển tốt ở các môi trường tổng hợp, đặc biệt phát triển tốt ở môi trường thạch máu hoặc huyết thanh. Nhiệt độ tối thích là 37oC , pHop=7.2. Trên môi trường thạch ,khuẩn lạc có dạng tròn trơn bóng,đục vun mờ. Ở môi trường lỏng, tế bào ở dạng cặn, vòng nhẫn mờ trong ống nghiệm ở bề mặt môi trường . Trang 20

Tải về miễn phí