Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
Bài thực tập 1: Phát hiện nhanh và bán định lượng AND bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch kết hợp nhuộm bằng Ethidium bromide.
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
Bài thực tập 1: Phát hiện nhanh và bán định lượng AND bằng
phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch kết hợp nhuộm bằng
Ethidium bromide.
1 Giới thiệu
AND phản ứng với Ethidium bromide tạo nên phức có khả năng phát huỳnh quang dưới
ánh sang tử ngoại. Các lượng ADN khác nhau khi được chấm lên nền thạch hay agarose có
chứa Ethidium bromide sẽ tạo nên các vòng sang có cường độ sang khác nhau. Trên cơ sở xây
dựng một dãy nồng độ ADN chuẩn và chấm lên đĩa thạch, đối chiếu với AND mẫu, chúng ta
có thể phát hiện được DNA ở giới hạn rất thấp ( Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
2. 2 Phương pháp tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị dãy 8 ống của DNA chuẩn có nồng độ chênh lệch nhau 2 lần:
• Đầu tiên cho vào mỗi ống 5µl đệm TE.
• Ống 8 cho thêm vào 5µl DNA chuẩn nồng độ 2µg/µl rồi trộn đều.
• Hút 5µl từ ống 8 cho vào ống 7 trộn đều…làm tương tự đến ống 2.
• Ông 1 để nguyên.
8 7 6 5 4 3 2 1
8 7 6 5 4 3 2 1
5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl
Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh
Page 2
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
Bước 2: Chuẩn bị 8 ống (được đánh dấu từ 916) chứa mẫu DNA cần xác địch làm
tương tự như trên. Chỉ khác là ống số 9 chứa mẫu có nồng độ gốc.
16 15 14 13 12 11 10 9
16 15 14 13 12 11 10 9
5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl
Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh
Page 3
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
Bước 3: Lấy 3µl trong mỗi ống nhỏ lần lượt vào 16 ô trên đĩa thạch đã chuẩn bị sẵn.
3µl
Bước 4: Cho đĩa peptri vào tủ ủ ở 37ºC Bước 5: Lấy đĩa thạch cho vào máy soi
UV
Bước 6: So màu bằng mắt thường và xác định kết quả.
Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh
Page 4
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
3 Kết quả
• Ta thấy ô số 8 với ô 16 và ô số 7 với ô 15 có màu tương đồng. Tức là ta
có nồng độ của mẫu bằng nồng độ của DNA chuẩn. Hay nồng độ
của mẫu cần xác định xấp xỉ 2µg/µl.
Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh
Page 5
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
Bài thực tập 2: Kỹ thuật các đoạn DNA được nhân bản đồng thời
(Multiplex PCR)
1 Gới thiệu
1.1 Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật cho phép nhân bản các đoạn DNA hay đoạn gen lên nhiều triệu lần thông
qua hàng loạt chu kỳ phản ứng tổng hợp của DNA polymerase. Kỹ thuật PCR yêu cầu
phải biết được thong tin về trình tự nucleotit ở hai đầu đoạn DNA cần nhân bản để
thiết keesneen cặp primer đặc hiệu.
Các giai đoạn chính của phản ứng PCR:
• Giai đoạn biến tính của DNA sợi kép: giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ
>90ºC, thường dung là 94-95ºC với thời gian từ vài chục giây đến 1 phút. Ở nhiệt độ
này DNA sợi kép bị tách thành 2 sợi đơn.
• Giai đoạn gắn primer: giai đoạn này thường được thực hiện ở nhiệt độ từ 50-65ºC
phụ thuộc vào nhietj đọ tách DNA sợi kép thành dạng sợi đơn (Tm) của primer. Trong
bước này xẩy ra sự bắt cặp của primer với các đoạn trình tự bổ sung trên DNA. Thời
gian cho giai đoạn này thường chỉ cần từ 30 giây đến 1 phút.
• Giai đoạn kéo dài chuỗi: giai đoạn này được thực hiện ở 70-72ºC là nhiệt độ tối thích
hợp của Taq DNA polymerase. Primer được kéo dài theo chiều 5’-3’ bởi Taq
polymerase với sự có mặt của dNTPs dưới các điều kiện phản ứng thích hợp. Kết quả
là tổng hợp được các đoạn DNA mới bổ sung với một phần trình tự của DNA khuôn.
Giai đoạn này thường khoảng từ 30 giây (cho các đoạn DNA cần nhân bản có kích
thước dưới 1kb) đến vài phút (cho các đoạn lớn hơn).
Ba giai đoạn biến tính, gắn primer và kéo dài chuỗi được gọi là chu kỳ của PCR. Sau
mỗi chu kỳ có số bản sao của đoạn DNA cần nhân bản tăng gấp đôi ban đầu. PCR
Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh
Page 6
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
thường được thự hiện với 25-30 chu kỳ, vì vậy từ một lượng DNA rất nhỏ ban đầu,
sau phản ứng ta có thể thu được một lượng bản sao lớn hơn gấp nhiều triệu lần so
với ban đầu.
1.2 Kỹ thuật multiplex PCR
Kỹ thuật này không khác nhiều so với kỹ thuật PCR thong thường. Điểm khác biệt
duy nhất là thay vì sử dụng 1 cặp mồi để nhân lên 1 loại DNA hay gen đích ở PCR
thong thường, multiplex PCR sử dụng từ 3 cặp mồi trở lên để nhân lên ít nhất là 2 loại
DNA hay gen đích tại cùng một thời điểm và cùng một chế độ nhiệt của chu kỳ phản
ứng PCR. Các đoạn DNA, gen được nhân lên đồng thời thường nhằm mục đích phát
hiện cùng một lúc nhiều đối tượng (loài,chủng…) khác nhau hoặc sang lọc các đối
tượng gây bệnh có khả năng đồng nhiễm ở một loại mẫu bệnh phẩm (máu, nước
tiểu, mô…). Vì thế, multiplex giúp giảm thiểu các thao tác và tiết kiệm thời gian trong
chẩn đoán, sang lọc phát hiện bệnh.
Các mồi trong multiplex PCR cần phải được tiết kế sao cho Tm xấp xỉ nhau để có thể
gắn bổ sung vào các gen đích tại cùng một nhiệt độ gắn mồi của chu kỳ phản ứng
PCR. Các mồi trong multiplex PCR cũng cần được thiết kế để tránh hiện tượng tự bắt
cặp bổ sung lẫn nhau hay bắt cặp không đặc hiệu vào gen đích của mồi kia tới ức chế
phản ứng kéo dài chuỗi của gen kia.
Hiện nay ký thuật multiplex PCR đã được áp dụng đẻ phát hiện các virus đồng nhiễm
lây truyền qua đường máu như HIV, HPV, và HCV, các loại ký sinh trùng gây bệnh sốt
rét, các loại các vi khuẩn và nám men gây bệnh phụ khoa, các vi khuẩn gây đường ruột
ngộ độc thực phẩm …
Trong thí nghiệm này chúng ta sử dụng primer được thiết kế và kỹ thuật mutiplext
PCR để phát hiện đồng thời hai loài ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và
Plasmodium vivax với kích thước băng DNA được nhân bản tương ứng là 205bp và
121bp. Quy trình thí nghiệm này là một phần kết quả của đề tài KC.10.08/06-10.
Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh
Page 7
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
2 Nội dung
2.1 Hóa chất
• Taq DNA polymerase (1 đơn vị/µ).
• Đệm cho Taq DNA polymerase đươch cung cấp nồng độ gấp 10 lần nồng hoạt động
(10xTaq buffer).
• dNTPs ở nồng độ 25mM cho mỗi loại dNTP (2mM).
• Primers (trong thí nghiệm này là Falci Fw, Falci Rv, Vivax Fw, Vivax Rv (10pmol/µl).
• DNA khuôn ở nồng độ 5-7ng/µl. Trong thí nghiệm này dung 4 loại DNA khác nhau đó
là DNA của Plasmodium falciparum, DNA của Plasmodium vivax, DNA từ mẫu máu
nghi nhiễm ký sinh trùng số 1 (M1), và số 2 (M2).
• dH2O khử trùng.
• Đệm TE.
2.2 Dụng cụ và máy móc
• Pipetman (1000, 100, 20µl), đầu côn vàng, đầu con xanh, ống eppendorf 0.5ml, giá để
ống eppendorf, máy PCR, mấy điện di ngang, bộ nguồn điện di và máy soi UV (UV
transilluminator).
2.3 Phương pháp tiến hành
Chuẩn bị hỗn hợp của các thành phần chung nhau cho 5 phản ứng (Master mix). Trong
đó các mẫu khác nhau sẽ khác nhau về DNA khuôn và primer, ngoài ra còn có 1 mẫu
kiểm tra không có DNA khuôn. Thể tích cuối cùng của mỗi phản ứng là 1.5ng/µl,
dNTPs là 0.2mM, DNA khuôn là 0.5-0.7ng/µl.
Bước 1: Chuẩn bị một ống eppendorf cho vào đó (tạo Master mix):
Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh
Page 8
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
• 62.5 µl dH2O
• 12.5 µl đệm Taq buffer (10x)
• 12.5 µl dNTP (2mM)
• 5µl Falci Fw (10pmol/µl)
• 5µl Falci Rv (10pmol/µl)
• 5µl Vivax Fw (10pmol/µl)
• 5µl Vivax Rv (10pmol/µl)
• 2.5µl Taq pol (1pmol/µl)
(Cho Taq pol vào sau cùng)
Master mix 110µl
Bước 2: Chia đều hỗn hợp cho 4 ống eppendorf, mỗi ống 22µl.
1 2 3 4
22µl 22µl 22µl 22µl
110µl
Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh
Page 9
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
Bước 4: Dùng pipetman cho thêm:
• 3µl TE vào ống 1 (đối chứng âm).
• 3µl DNA của P.falciparum và DNA của P.vivax vào ống số 2 (đối chứng dương).
• 3µl DNA mẫu 1 vào ống số 3.
• 3µl DNA của mẫu 2 vào ống số 4.
3µl TE 3µl P.fa+P.vi 3µl M1 3µl M2
1 2 3 4
25µl 25µl 25µl 25µl
(--) (+) M1 M2
Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh
Page 10
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
Bước 5: Chạy RAPD-PCR
• Tiến hành đặt RAPD-PCR với chế độ như sau:
• Bước biến tính ở 94ºC trong 3 phút(không lặp
lại).
• Bước biến tính ở 94ºC trong 35 giây.
• Bước gắn mồi ở 60ºC trong 15 giây.
• Bước kéo dài chuỗi ở 72ºC trong 20 giây.
• Đặt số chu kỳ lặp lại của 3 bước sau là 29 chu
kỳ.
• Đặt giữ mẫu ở 4ºC sau khi hoàn thành 29 chu
kỳ.
Bước 6: Tiến hành điện di với 5 giếng theo các bước:
• Đổ dung dịch đệm TAE vào bình
điện di
• Cho bản gel (agarose 2%) vào.
• Hút dung dịch màu (loting die) nhỏ
thành 5 giọt trên paraffin.
• Hút dịch từ 4 ống vừa PCR và 1
ống marker chuẩn bị trước nhỏ vào
5 giọt trên parafin trộn đều rồi nhỏ
vào 5 giếng điện di.
• Chạy điện di với thiết đặt 100V
trong 15 phút.
Bước 7: Quan sát kết quả trên gel.
Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh
Page 11
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
3 Kết quả
1 2 3 4
• Kết quả chụp điện di cho thấy tại vạch số 1 (đối chứng âm) không có vạch nào.
Tại vạch số 2 (đối chứng dương) có hai vạch trùng với vạch 100 và 200 trên băng
marker vạch số 5. Tại vạch số 3 (mẫu 1) có một băng trùng với băng 100 (kích
thước 121bp). Tại vạch số 4 (mẫu 2) có một băng trùng với băng 200(kích thước
205bp).
Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh
Page 12
Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học”
• Vậy có thể kết luận mẫu số 1 nhiễm ký sinh trùng sốt rét
Plasmodium vivax, mẫu số 2 nhiễm Plasmodium falciparum.
Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh
Page 13