Chương 6: Tạo dòng và xây dựng thư viện cDNA
Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy bởi các ribonuclease (RNase). Để thu được dịch chiết RNA có chất lượng tốt, cần phải giảm thiểu hoạt tính của RNase được giải phóng trong suốt quá trình sinh tan tế bào hoặc từ các nguồn tiềm tàng khác trong phòng thí nghiệm (dụng cụ, bàn làm việc, bàn tay của kỹ thuật viên...) bằng các nhân tố ức chế RNase, bao gồm các nhân tố ức chế protein của RNase, các phức hợp vanadyl-ribonucleoside hoặc macaloid. ...
Chương 6
Tạo dòng và xây dựng thư viện cDNA
I. Tách chiết, tinh sạch và phân tích RNA
1. Tách chiết và tinh sạch RNA
1.1. Tách chiết RNA tổng số
- Kiểm soát hoạt tính ribonuclease. Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy bởi các
ribonuclease (RNase). Để thu được dịch chiết RNA có chất lượng tốt, cần phải giảm thiểu hoạt tính của
RNase được giải phóng trong suốt quá trình sinh tan tế bào hoặc từ các nguồn tiềm tàng khác trong phòng
thí nghiệm (dụng cụ, bàn làm việc, bàn tay của kỹ thuật viên...) bằng các nhân tố ức chế RNase, bao gồm
các nhân tố ức chế protein của RNase, các phức hợp vanadyl-ribonucleoside hoặc macaloid.
- Nguyên lý. Phương pháp tách chiết RNA tổng số bao gồm các bước cơ bản giống như tách chiết
DNA. Tế bào hoặc mô được nghiền trong dung dịch có chứa chất tẩy mạnh là SDS (sodium dodecyl
sulphate, sarcocyl) ở nồng độ cao, các dung dịch muối mạnh (guanidinium thiocyanate-GTC) để hòa tan
RNA và kết tủa các protein bị biến tính ở cùng một thời gian, và một chất khử (b-mercaptoethanol). Hai
loại chất sau có tác dụng ức chế các RNase nội bào và tách các protein liên kết khỏi phân tử RNA. Bên
cạnh đó, có thể bổ sung các protease (chẳng hạn protease K) để gây biến tính các thành phần protein của
phức chất RNA-protein. Các protein được loại bỏ khỏi mẫu bằng cách chiết (ly tâm) với phenol,
phenol:chloroform và chloroform. RNA hòa tan trong pha nước được kết tủa bằng ethanol (hoặc
isopropanol) và được thu nhận lại qua ly tâm. RNA được bảo quản trên một năm ở -70oC trong nước có
chứa RNasin (nhân tố ức chế RNase).
1.2. Phân lập RNA poly(A)+
RNA tổng số của tế bào chứa khoảng 90-99% rRNA và tRNA, trong đó rRNA chiếm khoảng
80-85% và tRNA chiếm khoảng 15-20%. Các RNA này có kích thước và trình tự xác định và có thể được
tách riêng dễ dàng bằng điện di hoặc ly tâm. Riêng mRNA chỉ chiếm khoảng 1-5% RNA tổng số của tế
bào, lại có kích thước và trình tự rất đa dạng. Tuy nhiên, chúng có một điểm chung là cấu trúc đuôi polyA
(có thể lên tới 100A). Dựa vào cấu trúc này và đặc tính liên kết bổ sung A-T của nucleic acid, có thể tách
mRNA ra khỏi mẫu bằng sắc ký ái lực trên cột oligo(dT)-cellulose. Các mRNA sẽ bám lên cột thông qua
liên kết bổ sung với oligo(dT) và được thu nhận lại qua ly tâm. Kỹ thuật này cho phép thu nhận mRNA từ
những mẫu có khối lượng rất nhỏ.
Hình 6.1. Sơ đồ quy trình tinh sạch mRNA từ RNA tổng số
2. Phân tích RNA
2.1. Lai Northern (Northern hybridization)
Phân tích RNA là công việc quan trọng của nhiều nghiên cứu về sinh học phân tử, vì nó có thể cung
cấp thông tin về sự biểu hiện của gen trong cơ thể sống. Lai bằng màng lọc (nylon hoặc nitrocellulose) các
RNA được phân đoạn với đoạn mồi là nucleic acid đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P (hoặc
digoxigenin-dUTP) được gọi là phương pháp thẩm tích Northern (Northern blot). Phương thức này bắt
nguồn từ phân tích Southern blot (xem chương 5), dựa trên cơ sở khả năng bổ sung của các nucleic acid
sợi đơn để tạo thành các phân tử lai. Một cách tóm tắt, RNA được phân chia theo kích thước trên agarose
gel dưới các điều kiện biến tính, thẩm tích và liên kết không thuận nghịch với màng nylon hoặc
nitrocellulose, lai với đoạn mồi nucleic acid được đánh dấu 32P. Sau khi rửa trôi đoạn mồi không liên kết
hoặc liên kết không đặc hiệu, các phân tử RNA lai được phát hiện như là các băng phóng xạ tự ghi trên
phim X-quang (Hình 6.2).
Hình 6.2. Phân tích sự biểu hiện của gen bằng lai Northern. Hình phía dưới là điện di RNA tổng số trên agarose
gel được biến tính bằng formamide. Hình phía trên là tín hiệu phóng xạ thu được từ phản ứng lai giữa RNA tổng số
với mẫu dò được đánh dấu bằng 32P.
Thẩm tích Northern là phương pháp quan trọng để nghiên cứu biểu hiện của gen, do các RNA hiện
diện trong tế bào hoặc loại mô quy định mô tả khái quát một phần của genome được biểu hiện trong tế
bào hoặc mô đó. Phân tích Northern cho thấy mức độ ổn định của sự tích lũy chuỗi RNA qui định (thường
là mRNA) trong mẫu nghiên cứu. Vì thế, phân tích Northern cho phép người ta liên kết các mức độ biểu
hiện mRNA với các tính chất hình thái và sinh lý của cơ thể sống. Kỹ thuật lai Northern là một phương
pháp được ứng dụng rộng rãi cho việc phân tích biểu hiện gen. Ví dụ: kỹ thuật này đã được sử dụng cho
việc mô tả đặc điểm của các cDNA và gen được tạo dòng, nghiên cứu đặc trưng cơ quan/mô của sự biểu
hiện gen, phân tích hoạt tính của các gen nội và ngoại sinh trong cơ thể chuyển gen, và nghiên cứu sự biểu
hiện của gen trong mối liên quan với sự phát triển và các yếu tố vô sinh và hữu sinh.
2.2. Lai Dot (Dot hybridization)
Lai dot được Kafatos và cs. (1979) thực hiện đầu tiên bằng cách chấm các mẫu nhỏ của dung dịch
RNA lên màng nitrocellulose, sau đó màng được làm khô, lai với mẫu dò đặc trưng RNA hoặc DNA có
đánh dấu 32P, và ủ với phim X-quang. Mặc dù khó định lượng chính xác do kích thước của các chấm lớn
và khác nhau, nhưng trong nhiều trường hợp có thể thu được một ý tưởng tốt về cường độ biểu hiện của
một gen đặc biệt nào đó trong các mô đặc trưng hoặc các tế bào nuôi cấy (Hình 6.3).
Hình 6.3. Phân tích dot để định lượng RNA. Hàng phía dưới là các nồng độ RNA chuẩn đã biết. Hàng trên là các
nồng độ RNA khác nhau được tách chiết từ mô/cơ quan.
II. Tổng hợp cDNA (complementary DNA)
Phương pháp tổng hợp cDNA có nhiều thuận lợi do: (1) Lấy mRNA đúng của gen. (2) Không tốn
công phân tích những đoạn gen trùng lặp. (3) Chọn lọc dễ dàng trong một số trường hợp.
Ở đây chỉ trình bày phương pháp tổng hợp cDNA. Quá trình tổng hợp cDNA qua ba giai đoạn như
sau: (1) Tổng hợp sợi thứ nhất bằng enzyme reverse transcriptase. (2) Biến tính và cắt RNA trong thể lai
mRNA-cDNA tuần tự bằng nhiệt và enzyme RNase H của E. coli. Thay thế khuôn mẫu là chuỗi RNA
bằng chuỗi cDNA thứ nhất và tổng hợp sợi cDNA thứ hai nhờ DNA polymerase I của E. coli. (3) Cắt
vòng cặp tóc của cDNA sợi đôi nhờ nuclease S1 và sửa chữa hai đầu bằng đoạn Klenow (Hình 6.4).
1. Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất
1.1. Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase)
Nhân tố quan trọng nhất trong tổng hợp cDNA là chất lượng của enzyme phiên mã ngược được
sử dụng trong phản ứng. Mặc dù chất lượng của enzyme được sử dụng nói chung là tốt, song vẫn khó
loại trừ được RNase bẩn. Trở ngại này có thể khắc phục bằng cách dùng các nhân tố ức chế mạnh
RNase (RNase inhibitor), ví dụ như: vanadyl-ribonucleoside hoặc RNasin, trong phản ứng phiên mã
ngược.
Tỷ lệ enzyme phiên mã ngược dùng cho khuôn mẫu mRNA cũng có ảnh hưởng khác nhau đến
hiệu suất tổng hợp cDNA hoàn chỉnh. Nếu số lượng khuôn mẫu nhiều thì hiệu suất của sản phẩm
phiên mã cDNA sẽ tăng lên cùng với việc tăng số lượng enzyme reverse transcriptase. Trong nghiên
cứu, hiệu suất tối đa của các sản phẩm phiên mã cDNA hoàn chỉnh đạt đến 80 tiểu phần enzyme/mg
của khuôn mẫu, tỷ lệ enzyme cao như thế đòi hỏi phải sử dụng enzyme tinh sạch cao và bao gồm cả
các nhân tố ức chế RNase trong phản ứng.
1.2. Oligo dT primer
Các oligo dT primer được sử dụng để làm mồi cho phản ứng tổng hợp sợi cDNA thứ nhất dựa
trên khuôn mẫu của mRNA. Các oligo dT primer sẽ liên kết với đuôi polyA của mRNA.
1.3. Deoxynucleoside triphosphate (dNTP)
Nồng độ của bốn loại dNTP là yếu tố đặc biệt quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp
cDNA. Nếu nồng độ của một trong bốn dNTP giảm xuống dưới 10-50 mM thì hiệu suất của sản phẩm
phiên mã giảm rõ rệt. Khi sử dụng RNA của avian myeloblastosis virus làm khuôn mẫu thì việc sản
xuất các cDNA hoàn chỉnh tăng tối đa ở nồng độ 75 mM của cả bốn loại dNTP. Nồng độ của dNTP từ
200-250 mM đang được dùng phổ biến.
1.4. Các cation hóa trị 1 và hóa trị 2
Các điều kiện ion ảnh hưởng thật sự đến hiệu quả phiên mã của các khuôn mẫu khác nhau. Đối
với các sản phẩm phiên mã dài thì ion K+ có hiệu quả cao hơn ion Na +. Nồng độ K+ tối ưu cho quá
trình tổng hợp và kéo dài kích thước cDNA là khoảng từ 140-150 mM. Các cation hóa trị 2 là yêu cầu
tuyệt đối cho hoạt tính của enzyme phiên mã ngược. Không có hoạt tính nào được tìm thấy ở nồng độ
polymerase I của E. coli hoặc reverse transcriptase (Hình 6.4). Mặc dù người ta đã dự đoán cấu trúc vòng
đôi ở đầu tận cùng của các cDNA và cơ chế phát sinh của chúng, nhưng hiện tượng tổng hợp sợi cDNA
thứ hai vẫn chưa được nghiên cứu một cách hệ thống.
Tổng hợp sợi cDNA thứ hai bằng DNA polymerase I đã được sử dụng rộng rãi. Đoạn Klenow của
DNA polymerase I thiếu hoạt tính exonuclease 5'-3' cũng được sử dụng thành công để tổng hợp sợi cDNA
thứ hai.
Nhiều tác giả đã sử dụng reverse transcriptase để tổng hợp sợi cDNA thứ hai. Mặc dù có tác giả cho
rằng AMV reverse transcriptase không thể dùng để tổng hợp sợi thứ hai của cDNA immunoglobulin,
nhưng thành công của nhiều thí nghiệm dùng reverse transcriptase để tổng hợp sợi cDNA thứ hai đã cho
thấy việc sử dụng cả hai enzyme đều có thể cho kết quả tốt. DNA polymerase I và reverse transcriptase
có thể tạm ngừng hoặc ngừng lại ở các chuỗi khác nhau. Vì vậy, các sợi thứ hai được tổng hợp một cách
đặc biệt, chúng được sản xuất nhờ một enzyme và được mở rộng hoàn toàn nhờ một enzyme khác.
Hình 6.4. Sơ đồ tổng hợp đoạn cDNA từ khuôn mẫu mRNA
3. Cắt vòng cặp tóc nhờ nuclease S1
Sau khi tổng hợp cDNA hoàn toàn, sợi thứ nhất và thứ hai được liên kết cộng hóa trị bởi vòng cặp
tóc và vòng cặp tóc dễ bị cắt bởi nuclease S1. Sau đó, đoạn cDNA được sửa chữa bằng enzyme Klenow,
kết quả là hai đầu tận cùng là đầu bằng.
Sợi đôi cDNA sau đó được tách thành các tiểu phần theo kích thước và các phân tử lớn nhất được
gắn vào các plasmid của vi khuẩn. Hoặc là một tập hợp đầy đủ các kích thước của cDNA sợi đôi được tạo
dòng trong bacteriophage l để xây dựng thư viện cDNA (cDNA library). Tuy nhiên, việc đưa các đầu bằng
vào vector sẽ gây khó khăn trong việc lấy chúng ra khỏi vector một cách nguyên vẹn sau này. Do đó các
linker thường được nối vào hai đầu của các cDNA nhờ DNA ligase. Linker là những đoạn nucleotide ngắn
có chứa vị trí nhận biết của một loại RE (ví dụ: EcoRI) được tổng hợp nhân tạo tương ứng với vị trí nhận
biết RE (ví dụ: EcoRI) của vector. Sau đó, các cDNA mang linker và vector sẽ được cắt bởi cùng một
enzyme (ví dụ: EcoRI). Nhờ đó các cDNA và vector đều có đầu sole tương đồng (đầu dính) và cDNA sẽ
dễ dàng gắn cũng như lấy ra khỏi vector một cách nguyên vẹn.
III. Tạo dòng phân tử của cDNA sợi đôi
Có nhiều phương pháp khác nhau được dùng để liên kết cDNA sợi đôi với các plasmid vector. Đa
số được dùng theo các phương pháp sau:
- Bổ sung các đuôi đồng trùng hợp (homopolymetric tailing) cho cDNA sợi đôi và cho DNA của
plasmid vector. DNA vector và cDNA sau đó được nối bằng liên kết hydrogen giữa các đuôi đồng trùng
hợp bổ sung. Sự tạo thành vòng DNA đóng bằng enzyme gắn in vitro (DNA ligase) là cần thiết để hình
thành nên các plasmid tái tổ hợp trong E. coli.
- Bổ sung các đoạn nối nhân tạo (synthetic linkers) cho đầu tận cùng của DNA sợi đôi. Sau khi
phân cắt bằng RE thích hợp, các phân tử DNA được chuyển vào trong plasmid DNA cũng đã được cắt với
cùng một enzyme.
1. Đuôi đồng trùng hợp
1.1. Đuôi dA:dT
Enzyme terminal transferase xúc tác cho sự bổ sung của các deoxyrinucleotide triphosphate (dNTP)
vào đầu 3’-OH của DNA sợi đôi hoặc sợi đơn, được dùng để đưa DNA tái tổ hợp vào trong E. coli bằng
cách nối dA:dT. Thông thường từ 50-150 gốc dA được bổ sung vào vector DNA và một số tương ứng của
các gốc dT vào cDNA sợi đôi, cDNA sợi đôi được đưa vào trong các plasmid vector qua phương thức nối
dA:dT. Tuy nhiên, đuôi đồng trùng hợp dA:dT ít khi được dùng để tạo dòng cDNA, lý do chính là không
có phương thức thích hợp để cắt cDNA gắn trong plasmid nhờ đuôi dA:dT.
1.2. Đuôi dC:dG
Phương pháp được sử dụng rộng rãi hơn để tạo dòng các cDNA bằng đuôi đồng trùng hợp đòi hỏi bổ
sung các đuôi dC cho cDNA sợi đôi và các đuôi dG được bổ sung vào plasmid vector đã được cắt hạn chế
bằng PstI. Enzyme PstI cắt chuỗi 5’…CTGCAG…3’ tạo ra đầu 3’ tận cùng là cơ chất lý tưởng cho việc
bổ sung các đuôi đồng trùng hợp. Các dòng cDNA mang các đuôi dC:dG có thể dễ dàng tách ra khỏi
plasmid bằng cách thủy phân nhờ PstI (Hình 6.5).
Số lượng các gốc dA:dT và dC:dG cần thiết để cho hiệu suất gắn tối thích cDNA vào plasmid vector
đã được xác định, số lượng các gốc trên plasmid và cDNA phải xấp xỉ nhau, với khoảng 100 gốc được bổ
sung tới mỗi DNA để nối dA:dT và khoảng 20 gốc để nối dC:dG.
2. Các linker và adapter nhân tạo
Các linker chứa một hoặc nhiều vị trí cắt hạn chế cho phép nối cDNA sợi đôi với các plasmid vector
hoặc bacteriophage l vector. cDNA sợi đôi được xử lý với DNA polymerase của bacteriophage T4 hoặc
DNA polymerase I của E. coli, các enzyme này loại bỏ đầu tận cùng 3’ sợi đơn so le bằng hoạt tính
exonuclease 3’® 5’ và lấp đầy các đầu tận cùng 3’-OH bị khuyết bằng hoạt tính trùng hợp
(polymerization). Sự phối hợp của các hoạt tính này đã tạo ra các phân tử DNA đầu bằng, sau đó các
cDNA này được ủ với một số lượng lớn các phân tử linker với sự có mặt của bacteriophage T4 DNA
ligase (enzyme xúc tác cho quá trình gắn của các phân tử DNA đầu lồi với linker) (Hình 6.6).
Hình 6.5. Tạo dòng cDNA sợi đôi bằng đuôi đồng trùng hợp dG:dC. Enzyme terminal transferase có hoạt
tính tạo nhóm homopolymer ở đầu 3’-OH của DNA sợi đôi làm lồi ra một đầu ở cuối cơ chất của nó là DNA sợi
đơn.
Hình 6.6. Minh họa một linker. (a) Đoạn 5’-CCGGATCCGG-3’ mang vị trí nhận biết cho BamHI. (b)
Linker này được gắn vào cDNA đầu bằng nhờ DNA ligase. (c) Cấu trúc này sau đó được cắt bằng BamHI để tạo ra
đầu 5’ lồi.
Các phân tử DNA sợi đôi mang các đầu kết dính nhân tạo được cắt ở vị trí cắt hạn chế trong linker,
tinh sạch, và sau đó gắn với vector cũng được cắt bằng RE tương ứng tạo ra các đầu dính tương đồng với
các đầu của linker. Có thể hạn chế sự tái tạo lại vòng của plasmid vector (không tái tổ hợp) bằng cách xử
lý các vector được cắt bằng enzyme phosphatase (calf intestinal alkaline phosphatase-CIAP) trước khi
thực hiện phản ứng gắn với cDNA.
Việc sử dụng adapter có hiệu quả hơn linker. Các adapter có kích thước ngắn, là các oligonucleotide
sợi đôi mang một đầu bằng (để gắn với cDNA sợi đôi) và một đầu tận cùng kết dính (để gắn với đầu tận
cùng tương ứng trong vector). Không giống như linker, các adapter không đòi hỏi phải cắt bằng các RE
sau khi chúng được gắn với cDNA sợi đôi. Tuy nhiên, các phân tử cDNA mang các adapter được
phosphoryl hóa (phosphorylation) có thể tạo thành các phân tử mạch vòng đóng bằng liên kết cộng hóa trị
(dạng không thể tạo dòng) hoặc các phân tử mạch thẳng dạng khảm (dạng hoàn toàn không mong muốn)
trong suốt phản ứng gắn tuần tự với sự có mặt của vector DNA đã được dephosphoryl hóa (Hình 6.7).
Hình 6.7. Minh họa một adapter. (a) Adapter, có đầu tận cùng 5’ tương ứng với enzyme HindIII, được gắn vào
cDNA đầu bằng nhờ DNA ligase. (b) Đầu 5’ của adapter có thể được dephosphoryl hóa để ngăn cản sự tự kết nối
lại.
Khi nối các linker hoặc adapter với các phân tử cDNA sợi đôi đầu bằng, phản ứng gắn cần được tiến
hành trong một dung tích tối thiểu (để duy trì một nồng độ cao của linker/adapter). Nồng độ phân tử của
linker/adapter phải lớn hơn nồng độ của đầu tận cùng của cDNA ít nhất là 100 lần. Cuối cùng, trước khi
đoạn cDNA được gắn vào vector, các adapter không có phản ứng và các sản phẩm có trọng lượng phân tử
thấp (do phản ứng cắt hạn chế tạo ra) cần được loại bỏ bằng sắc ký cột, điện di agarose hoặc
polyacrylamide gel.
IV. Các phương pháp tạo dòng cDNA khác
1. Tạo dòng mRNA-cDNA
Một phương pháp khác để tạo dòng cDNA là biến nạp vào E. coli các thể lai mRNA-cDNA đã được
gắn với các plasmid vector. Các vi khuẩn vật chủ loại bỏ mRNA và thay thế nó bằng DNA. Sau khi sợi
cDNA đầu tiên được tổng hợp theo cách thông thường, các gốc dA được bổ sung cho thể lai
mRNA-cDNA sau đó được ủ với plasmid mang các đuôi dT. Do đầu tận cùng 3’-OH của RNA kém ít nhất
10 lần trong phản ứng tương đồng với DNA nên hầu hết các gốc dA được bổ sung cho thể lai đều phối
hợp ở đầu 3’ của DNA. Việc nối các đầu khác của thể lai với vector có khả năng thành công do mối liên
kết hydrogen giữa poly(A) tự nhiên ở đầu 3’ của mRNA và plasmid có đuôi dT. Phương pháp này có một
số thuận lợi sau:
- Không cần tổng hợp sợi cDNA thứ hai.
- Cắt vòng cặp tóc DNA bằng nuclease S1 là không cần thiết.
Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là có hiệu quả kém ít nhất 10 lần so với phương pháp tạo
dòng cDNA sợi đôi và vì thế không thích hợp cho việc xây dựng một số lượng lớn các dòng cDNA.
2. Bổ sung tuần tự các linker khác nhau
cDNA sợi đôi, được tổng hợp bằng cơ chế tự mồi (self-priming), được gắn vào một loại linker nhân
tạo trước khi vòng cặp tóc trong cDNA bị cắt. Vì thế, các linker chỉ được bổ sung ở một đầu của cDNA
sợi đôi (đầu tương ứng với đầu tận cùng 3’ của mRNA). Sau đó cDNA được tinh sạch khỏi các linker
thừa, vòng cặp tóc được cắt bằng nuclease S1 và sửa chữa bằng đoạn Klenow của DNA polymerase I của
E. coli trước khi loại linker thứ hai được gắn vào cDNA. Các linker này sẽ được gắn vào cả hai đầu của
cDNA. cDNA được gắn linker kép sau đó được xử lý với các RE thích hợp và gắn vào trong vector bằng
phương pháp tạo dòng định hướng (Hình 6.8).
Phương pháp này được dùng để gắn cDNA theo hướng chính xác của các promoter cho phép biểu
hiện các đoạn chèn (inserted sequences) trong vi khuẩn. Các bacteriophage l vector cho phép tạo dòng
định hướng cũng đã được phát triển trong thời gian gần đây.
3. Tạo dòng cDNA bằng các primer-adapter
Ngày nay, việc sản xuất dễ dàng các oligonucleotide primer của các trình tự xác định đã cho phép
phát triển các phương pháp tạo dòng sử dụng primer-adapter chứa một vùng của DNA đồng trùng hợp ở
đầu tận cùng 3’ và một vị trí cắt hạn chế ở đầu tận cùng 5’. Các chuỗi đồng trùng hợp được dùng làm mồi
để tổng hợp sợi thứ nhất và sợi thứ hai của cDNA, và các vị trí cắt hạn chế bên cạnh được sử dụng để đưa
các phân tử cDNA sợi đôi cuối cùng vào trong một vector thích hợp. Trong mô hình đơn giản nhất,
phương pháp này cho phép các cDNA được tạo dòng với hiệu suất cao (Hình 6.9).
Hình 6.8. Tạo dòng cDNA bằng cách bổ sung tuần tự các linker nhân tạo. Đoạn Klenow tạo đầu bằng cho
cDNA sợi đôi và enzyme nuclease S1 cắt vòng cặp tóc. Các linker thứ nhất và thứ hai được gắn tuần tự vào hai đầu
của cDNA, sau đó đoạn cDNA này sẽ được cắt cùng enzyme hạn chế với vector tạo dòng có vị trí nhận biết trên hai
linker nhân tạo. Cuối cùng, đoạn cDNA có hai đầu tương đồng được gắn với vector và biến nạp vào E. coli.
Hình 6.9. Tổng hợp cDNA sợi đôi bằng phương pháp primer-adapter
Đoạn cDNA được tổng hợp theo phương pháp trên khi gắn vào trong các vector biểu hiện như lgt20
và lgt22 chỉ có 1/6 cơ hội biểu hiện trong vi khuẩn, lý do: chỉ một nửa các phân tử cDNA được đưa vào
trong vector theo hướng chính xác đối với promoter lacZ, và chỉ một trong ba phân tử được gắn ở hướng
phải sẽ ở trong khung đọc chính xác để sản xuất protein hợp nhất.
V. Các bacteriophage l vector dùng trong tạo dòng cDNA
1. Các bacteriophage l vector được dùng phổ biến
Hai loại vector biểu hiện của bacteriophage l thường dùng để xây dựng thư viện cDNA là lgt10 và
lgt11. Vector lgt10 dùng để xây dựng các thư viện chỉ được sàng lọc bằng các mẫu dò nucleic acid, trong
khi vector lgt11 dùng để xây dựng các thư viện được sàng lọc bằng các mẫu dò miễn dịch để phân lập các
chuỗi DNA mã hóa các kháng nguyên đặc hiệu.
1.1. Vector lgt10
lgt10 là vector được thiết kế để nhận các đoạn DNA ngoại lai trong vùng mã hóa của gen ức chế cI2.
Các vector này mang gen cI, giống như bacteriophage l, nó tạo thành các vết tan mờ đục trên hầu hết các
chủng E. coli. DNA của lgt10 mang vị trí nhận biết đơn EcoRI nằm trong vùng mã hóa của gen cI là nơi
mà các đoạn DNA có thể gắn vào. Kết quả chèn đoạn DNA sẽ làm bất hoạt gen cI, sản sinh ra các
bacteriophage cI tái tổ hợp và tạo thành các plaque màu sáng, dễ dàng phân biệt với các plaque mờ đục
của lgt10 bố mẹ.
DNA của lgt10 bố mẹ xấp xỉ 43 kb và như vậy có thể nhận các đoạn DNA ngoại lai dài tới 7,6 kb.
Các thư viện cDNA được xây dựng trong lgt10 luôn chứa hỗn hợp các bacteriophage tái tổ hợp và không
tái tổ hợp. Hai loại bacteriophage này có thể phân biệt kiểu hình nhờ vào khả năng tạo thành các plaque
của chúng.
1.2. Vector lgt11
lgt11 là vector biểu hiện mang bản sao của gen lacZ của E. coli, có vị trí nhận biết đơn EcoRI nằm
ở vùng ngược hướng 53 bp của codon kết thúc dịch mã của gen lacZ. DNA ngoại lai có kích thước xấp xỉ
7,2 kb có thể được gắn ở vị trí này. Các chuỗi mã hóa gắn trong khung đọc theo hướng chính xác sẽ được
biểu hiện để sản xuất các protein dung hợp (fusion protein) có đầu tận cùng amino chứa các chuỗi
b-galactosidase và đầu tận cùng carboxyl chứa mạch polypeptide ngoại lai. Một số protein dung hợp này
sẽ thể hiện các yếu tố quyết định kháng nguyên (epitopes) được phát hiện bởi khả năng phản ứng với các
kháng thể của chúng.
Các protein dung hợp mang các yếu tố quyết định kháng nguyên ngoại lai có thể được phát hiện
bằng cách sàng lọc các plaque với mẫu dò miễn dịch. Bacteriophage được dàn trải ở 42oC trên E. coli.
Sau khoảng 4 giờ, các đĩa petri được chuyển đến nhiệt độ 37oC và được phủ màng lọc vô trùng
nitrocellulose có thấm isopropylthio-b-D-galactoside (IPTG), chất làm bất hoạt gen ức chế lac và cảm ứng
biểu hiện protein ngoại lai. Sau một vài giờ nuôi ở 37oC, các màng lọc được ủ với kháng thể để liên kết
với kháng nguyên quan tâm. Các kháng thể này sau đó được phát hiện bằng các xét nghiệm hóa học
phóng xạ (radiochemistry) hoặc hóa học mô (histochemistry).
2. Một số bacteriophage l vector khác
2.1. Vector lgt18 và lgt19
Hai loại vector lgt18 và lgt19 có nguồn gốc từ vector lgt11 được cải tiến mang vùng tạo dòng
(polycloning sites) ở vị trí EcoRI đơn của lgt11. Có thể sử dụng hai loại vector này để tạo dòng định
hướng và không định hướng cDNA. Hơn nữa, ít nhất một trong các vị trí của vùng tạo dòng (SalI) ít khi
xuất hiện trong DNA động vật có vú (trung bình 1 vị trí/đoạn 100 kb), và vì thế ít có khả năng các dòng
cDNA có chứa vị trí SalI. Như vậy, các cDNA sợi đôi có đầu bằng mang các linker SalI không cần phải
được bảo vệ bằng cách methyl hóa (methylation) trước khi được thủy phân bằng RE. Khi các đoạn linker
được loại bỏ, sẽ dẫn đến kết quả quần thể các phân tử cDNA có thể được gắn trực tiếp với các nhánh của
lgt18 hoặc lgt19.
2.2. Vector lgt20 và lgt21
Các vector lgt20 và lgt21 có nguồn gốc tương ứng từ lgt18 và lgt19, và như vậy có nhiều tính chất
giống như đã mô tả ở lgt18 và lgt19. Những thay đổi đặc biệt so với lgt18 và lgt19 như sau:
- Vị trí tổng hợp chi được đưa vào vector cho phép loại bỏ sự chọn lọc đoạn chèn cDNA chứa các vị
trí chi.
- Các vị trí SacI và XbaI được loại bỏ khỏi các nhánh của vector sao cho vị trí XbaI ở trong vùng
tạo dòng là duy nhất, các thao tác này làm khuyết một đoạn khoảng 500 bp trong DNA của bacteriophage
l ở phía bên phải gen lac5. Đặc điểm này cho phép nhận các đoạn chèn DNA lớn hơn (tới 8,2 kb) so với
các vector lgt18 và lgt19.
2.3. Vector lgt22 và lgt23
Các vector này cũng bắt nguồn từ lgt18 và lgt19, mang trình tự tổng hợp chi và các vị trí tạo dòng
trong một khung khác gần đầu 3’ của vùng mã hóa gen lacZ. Các vector lgt22 và lgt23 giống hệt nhau
ngoại trừ hướng của các vị trí tạo dòng. Các vị trí XbaI và SacI ở các nhánh của lgt18 và lgt19 bị loại bỏ,
như vậy các vector này chỉ mang năm vị trí cắt hạn chế duy nhất để tạo dòng là: NotI, XbaI, SacI, SalI và
EcoRI. Các đoạn cDNA gắn vào một trong năm vị trí có thể được biểu hiện như là một protein dung hợp
LacZ. Các vector lgt22 và lgt23 được thiết kế để cho phép tạo dòng định hướng cDNA vào trong các vị trí
SalI và NotI. Tổng hợp sợi thứ nhất và thứ hai của cDNA bằng phương pháp primer-linker cho phép
cDNA sợi đôi được cắt bằng SalI và NotI và gắn trực tiếp trong các nhánh của vector theo hướng liên
quan với promoter lacZ. Một trong ba thể tái tổ hợp sẽ mang phân tử cDNA trong khung đọc chính xác để
sản xuất protein dung hợp.
2.4. Vector lZAP
Vector lZAP mang vùng tạo dòng cùng hướng với promoter lacZ của E. coli. Đoạn cDNA dài 10 kb
có thể được gắn vào trong các vị trí này và biểu hiện hoặc trong vi khuẩn được xâm nhiễm hoặc trong các
thể tiềm tan được cảm ứng, như mô tả ở lgt11. Hơn nữa, các protein dung hợp lZAP có thể được biểu hiện
từ các plasmid có số lượng bản sao lớn. Vector lZAP có một số đặc điểm như sau:
- Có sáu vị trí RE trong vùng tạo dòng được sử dụng để tạo dòng định hướng các phân tử cDNA,
trong đó có một vị trí cắt EcoRI tương tự như lgt11.
- Có các promoter của bacteriophage T3 và T7 nằm bên cạnh vùng tạo dòng.
- Có các trình tự có nguồn gốc từ bacteriophage f1 để chuyển đổi in vivo đoạn chèn DNA từ
bacteriophage l vector tới Bluescript plasmid, các trình tự của nó được chứa trong lZAP. Quá trình cắt bỏ
được thực hiện dễ dàng nhờ sự bố trí các trình tự của bacteriophage f1 (khởi đầu tổng hợp DNA sợi đơn)
về một phía của Bluescript plasmid DNA mang vùng tạo dòng và sự bố trí các trình tự bacteriophage f1
(kết thúc tổng hợp DNA sợi đơn) về một phía khác của plasmid DNA.
Vector lZAP là dạng đầu tiên của vector thế hệ mới được thiết kế nhằm cung cấp một trình tự các vị
trí tiềm năng để tạo dòng và biểu hiện cDNA, một phương pháp tiện lợi và đơn giản để thu hồi và thực
hiện các thao tác tiếp theo của cDNA. Do tính linh hoạt của chúng, các vector này thay thế cho lgt10 và
lgt11 và được xem là vector thích hợp để xây dựng các thư viện cDNA. Vector lZAPII cũng tương đồng
với lZAP.
VI. Nhận dạng các dòng cDNA quan tâm
1. Các phương pháp sàng lọc
Có ba phương pháp sàng lọc thư viện cDNA cho các dòng quan tâm:
- Lai nucleic acid.
- Phát hiện các kháng nguyên miễn dịch đặc hiệu.
- Chọn lọc sib các dòng cDNA.
Dưới đây chỉ trình bày hai phương pháp phổ biến đó là lai nucleic acid và phát hiện các kháng
nguyên miễn dịch đặc hiệu.
1.1. Lai nucleic acid
Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến và đáng tin cậy nhất khi sàng lọc các thư viện cDNA để
tìm kiếm các dòng quan tâm. Sàng lọc bằng phương pháp lai nucleic acid cho phép phân tích đồng thời
nhiều dòng và nhanh, không đòi hỏi các dòng cDNA phải hoàn chỉnh và sản phẩm được tổng hợp trong tế
bào vật chủ phải có hoạt tính sinh học hoặc kháng nguyên. Hơn nữa, cơ sở lý thuyết của kỹ thuật lai
nucleic acid đã được hiểu biết đầy đủ. Điều này cho phép phát triển một số lượng lớn các kỹ thuật khác
nhau có thể điều chỉnh các mẫu dò của nucleic acid có các chiều dài và đặc điểm khác nhau.
- Các mẫu dò tương đồng. Các mẫu dò tương đồng chứa ít nhất một phần của chuỗi nucleic acid
chính xác của dòng cDNA mong muốn. Chúng được dùng trong nhiều trường hợp khác nhau, ví dụ: khi
một dòng bộ phận của cDNA hiện có được sử dụng để phân lập một dòng hoàn chỉnh từ thư viện cDNA.
Thông thường, đoạn bắt nguồn từ một đầu hoặc đầu khác của dòng hiện có được phân lập, đánh dấu
phóng xạ in vitro và dùng để thăm dò thư viện. Lai với các mẫu dò tương đồng thường được tiến hành
dưới các điều kiện nghiêm ngặt (stringency).
- Các mẫu dò tương đồng từng phần. Các mẫu dò tương đồng từng phần được dùng để phát hiện
các dòng cDNA có quan hệ họ hàng, nhưng không giống hệt nhau hoàn toàn, với các trình tự của mẫu dò.
Nếu các mẫu dò kháng thể lẫn nucleic acid không có sẵn, thì có thể thay đổi bằng một vài phương pháp.
Ví dụ: Nếu dùng gen đã được tạo dòng từ các loài khác hoặc nếu gen liên quan đã được tạo dòng từ cùng
loài, thì cần tiến hành một loạt các thí nghiệm kiểm tra xem có sự bảo toàn đầy đủ của trình tự nucleic
acid hay không để cho phép sàng lọc thư viện cDNA bằng cách lai. Điều này được thực hiện dễ dàng nhất
bằng cách tổ chức một loạt các phản ứng lai Southern và Northern ở các mức độ nghiêm ngặt khác nhau.
Dùng một lượng tối thiểu (5-10 mg) của genomic DNA đã được cắt bằng RE để chạy điện di trên agarose
gel 0,8%, các phân đoạn sau đó được chuyển vào màng lai nitrocellulose. Màng được cắt thành từng mảnh
nhỏ, mỗi mảnh được lai dưới các điều kiện khác nhau với các lượng mẫu dò có hoạt tính phóng xạ giống
nhau. Một loạt các phản ứng lai tương tự có thể tiến hành với các mRNA được tiểu phần hóa bằng điện di
và chuyển lên giá thể rắn. Mục đích của cả hai trường hợp là thiết lập các điều kiện cho phép các gen
được tạo dòng trước đó được sử dụng như là mẫu dò cho cDNA quan tâm.
- Các oligonucleotide mẫu dò nhân tạo. Các oligonucleotide mẫu dò nhân tạo là các đoạn
nucleotide của trình tự xác định được tổng hợp in vitro. Trình tự của các mẫu dò này được suy luận, bằng
cách dùng mã di truyền, từ các vùng ngắn của chuỗi amino acid đã biết của protein quan tâm. Do sự thoái
biến (degeneracy) của mã di truyền, chuỗi amino acid đề xuất có thể không được đặc trưng chính xác bởi
các oligonucleotide đơn được dự đoán cho trình tự. Mặc dù, trong rất nhiều trường hợp, trình tự các
amino acid giống nhau có thể được đặc trưng bởi nhiều oligonucleotide khác nhau. Không có cách nào để
biết chắc chắn các oligonucleotide này trên thực tế có được dùng trong gen quan tâm hay không. Ba giải
pháp được đưa ra cho vấn đề này là như sau:
+ Một họ oligonucleotide có thể được tổng hợp chứa tất cả các trình tự có khả năng mã hóa cho một
trình tự đã cho của chuỗi amino acid. Số lượng các thành viên trong họ này tùy thuộc vào mức độ thoái
biến của mã bộ ba cho các amino acid đặc biệt. Tuy nhiên, do tất cả các trình tự oligonucleotide có khả
năng được hiện diện, nên ít nhất một trong số các thành viên sẽ tương hợp với dòng cDNA quan tâm. Duy
trì kích thước của mỗi họ trong tỷ lệ dễ sử dụng, các oligonucleotide ngắn (14-17 base) thường được sử
dụng, một kích thước tối thiểu được tiến hành cho phản ứng lai.
+ Oligonucleotide dài hơn (40-60 base) của trình tự duy nhất có thể được tổng hợp bằng cách dùng
các mã bộ ba được sử dụng phổ biến nhất cho mỗi amino acid (tránh dùng dinucleotide CpG, vì nó được
hiện diện lại trong hầu hết các cDNA của eukaryote). Tất nhiên, oligonucleotide này sẽ không tương hợp
một cách chính xác với trình tự trong cDNA, nhưng nó sẽ cố định đủ tốt để phát hiện bằng cách lai dưới
các điều kiện không nghiêm ngặt (non-stringency).
+ Một oligonucleotide có thể được tổng hợp chứa một base như là inosine ở các vị trí thoái biến
tiềm tàng. Inosine có thể bắt cặp với tất cả bốn loại base truyền thống mà không làm tổn thương nghiêm
trọng khả năng ổn định của các thể lai có kết quả. Vì thế, nó có khả năng sản sinh ra các họ
oligonucleotide dài hơn được làm giảm số lượng và còn lai với gần như tất cả các dòng cDNA có thể mã
hóa cho protein quan tâm.
Cuối cùng, nếu trình tự protein có sẵn từ đầu tận cùng amino của protein, thì thư viện cDNA được
sàng lọc phải có chất lượng cao để chắc chắn rằng hầu hết đầu tận cùng 5’ của mRNA được đại diện.
1.2. Phát hiện miễn dịch các kháng nguyên đặc hiệu
Các thư viện cDNA được xây dựng trong các vector biểu hiện như lgt11, lgt18-23, lZAP... có thể
được sàng lọc bằng kháng thể theo hướng chống lại protein quan tâm. Các màng lọc nitrocellulose in các
vết tan của vi khuẩn được ngâm trong dung dịch chứa kháng thể. Sau khi rửa, màng lọc được ủ với protein
A của Staphylococcus aureus hoặc bằng kháng thể thứ hai theo hướng chống lại các yếu tố quyết định
kháng nguyên đặc hiệu loài của kháng thể thứ nhất. Ở các mô tả đầu tiên của phương pháp này, phối tử
(ligand) thứ hai được đánh dấu đồng vị phóng xạ với 125I. Ngày nay, phối tử thứ hai được liên kết hóa trị
với enzyme mà hoạt tính của enzyme có thể được phát hiện bằng hóa tổ chức học (ví dụ: alkaline
phosphatase).
Chìa khóa thành công của phương pháp này nằm trong chất lượng của kháng thể. Điều cần thiết là
kháng thể nhận diện được protein bị biến tính (Ví dụ: nó phải cho các tín hiệu mạnh trong phân tích
Western blot-xem chương 7). Hơn nữa, quá trình sàng lọc được tiến hành dễ dàng hơn và mẫn cảm hơn
nếu kháng thể được bắt nguồn từ huyết thanh đa dòng (polyclonal antiserum) độ chuẩn cao. Bởi vì các
huyết thanh như thế phản ứng bình thường với nhiều yếu tố quyết định kháng nguyên khác nhau, cơ hội
để phát hiện dòng cDNA biểu hiện đoạn protein quan tâm được tăng lên. Các huyết thanh đa dòng thường
chứa các kháng thể phản ứng chéo nhận diện các thành phần không tái tổ hợp của vi khuẩn tiềm tan và
chúng phải được loại bỏ trước khi quá trình sàng lọc được thực hiện.
Phản ứng liên kết không đặc hiệu sẽ thấp hơn nhiều khi sử dụng kháng thể đơn dòng làm mẫu dò.
Tuy nhiên, số lượng các thể tái tổ hợp có thể được phát hiện cũng bị giảm bởi vì mỗi kháng thể đơn dòng
riêng biệt có thể phản ứng với chỉ một yếu tố quyết định kháng nguyên đơn. Vì thế, mẫu dò miễn dịch lý
tưởng có thể chứa một hỗn hợp của nhiều kháng thể đơn dòng khác nhau, mà mỗi kháng thể phản ứng
mạnh với protein bị biến tính.
2. Các phương pháp xác nhận các dòng cDNA
Các thư viện cDNA thường được dàn trải ở mật độ cao để sàng lọc với kháng thể hoặc các mẫu dò
của nucleic acid, và mỗi dòng phản ứng dương tính trong vòng đầu tiên đòi hỏi một số chu kỳ dàn trải và
sàng lọc bổ sung trước khi chúng được xem như thuần khiết. Tuy nhiên, khả năng phản ứng thích hợp với
mẫu dò đặc biệt là không đầy đủ để chứng minh dòng cDNA thu được bắt nguồn từ mRNA quan tâm. Sự
chứng minh chỉ tuyệt đối khi cho thấy dòng cDNA chứa một khung đọc mở mã hóa cho trình tự amino
acid hoàn toàn của protein. Một số vấn đề sau cần được lưu ý để đảm bảo mức độ chính xác của các dòng
cDNA thu được:
- Biểu hiện của protein từ cDNA hoàn chỉnh trong các tế bào prokaryote hoặc eukaryote thể hiện
các hoạt tính sinh học hoặc enzyme chính xác.
- Sự tương ứng giữa các phần của chuỗi nucleotide của cDNA và các chuỗi amino acid của các
peptide có nguồn gốc từ protein được tinh sạch.
- Sự tương ứng giữa các bản đồ peptide của chuỗi polypeptide được tổng hợp in vitro bằng sự phiên
mã của dòng cDNA và các bản đồ peptide của protein đích thực.
- Sự kết tủa miễn dịch của polypeptide được tổng hợp in vitro hoặc in vivo từ sự phiên mã dòng
cDNA bằng các kháng thể được tăng khả năng chống lại protein quan tâm. Sự chặt chẽ của thử nghiệm
này tăng lên khi nó được tiến hành bởi một chuỗi các kháng thể đơn dòng xác nhận các yếu tố quyết định
kháng nguyên khác nhau trên phân tử protein.
- Kết tủa miễn dịch protein đích thực với các kháng thể tăng khả năng chống lại các peptide tổng
hợp mà các trình tự của chúng được xác định bởi trình tự nucleic acid của cDNA được tạo dòng.
VII. Xây dựng thư viện cDNA trong bacteriophage l vector
Sử dụng thư viện cDNA có hai ưu điểm sau:
- Các dòng cDNA chứa trình tự mã hóa liên tục của một gen. Nhiều gen ở eukaryote là gián đoạn,
có chứa nhiều đoạn intron. Sau khi cắt tiền thân mRNA (pre-mRNA) và nối lại, các đoạn intron đã bị loại
và mRNA hoàn thiện (mature mRNA) có trình tự mã hóa liên tục được tạo thành. Do cDNA được phiên
mã ngược từ khuôn mẫu mRNA hoàn thiện nên các dòng cDNA có thể tổng hợp protein cần thiết với số
lượng lớn như mong muốn.
- Nhiều protein được tổng hợp với số lượng lớn bởi những tế bào chuyên hóa và như vậy trong các
tế bào này mRNA của protein đó sẽ có tỷ lệ cao và thư viện cDNA được tạo ra từ các tế bào này sẽ có
nhiều cDNA mã hóa cho các protein tương ứng. Sự dồi dào cDNA của một vài loại mRNA nào đó làm
giảm nhẹ đáng kể việc xác định đúng dòng mong muốn từ thư viện gen.
Phương pháp tổng hợp gen từ mRNA ngày càng được phát triển, nó kết hợp với các phương pháp
khác của sinh học phân tử cho phép ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.
Các bước chính của quá trình xây dựng thư viện cDNA như sau:
1. Chọn lọc kích thước của cDNA
cDNA sau khi cắt hạn chế được phân đoạn bằng sắc ký cột Sepharose để loại bỏ những linker thừa
và các phân tử cDNA có kích thước nhỏ hơn 500 bp. Cột sắc ký thường có kích thước 27´0,3 cm thích
hợp cho việc phân đoạn các cDNA.
2. Gắn các cDNA với các nhánh của bacteriophage l
Thông thường cần phải tiến hành thử một loạt các phản ứng gắn và phản ứng đóng gói. Trong các phản
ứng này, một lượng không đổi của các nhánh bacteriophage l được gắn với các lượng khác nhau của cDNA,
mục đích là để xác định lượng cDNA tạo ra ít nhất là 5´ 106 bacteriophage tái tổ hợp.
Phản ứng gắn cần được thiết kế sao cho tối thiểu một bacteriophage tái tổ hợp đơn sẽ chứa nhiều
hơn một phân tử cDNA bằng cách dùng tỷ lệ của các nhánh được phosphoryl hóa và cDNA để chỉ 5%
bacteriophage được tái tổ hợp. Nếu sử dụng các nhánh dephosphoryl hóa, thì các bacteriophage không tái
tổ hợp bị ức chế hiệu quả, và vì thế không thể xác định lượng cDNA cần thiết để tạo ra một quần thể
bacteriophage chứa 5% thể tái tổ hợp.
Việc sử dụng các nhánh dephosphoryl hóa hoặc các nhánh có đầu tận cùng không tương thích, tạo
ra bằng cách lấp đầy từng phần, được khuyến cáo sử dụng khi xây dựng thư viện cDNA trong các
bacteriophage như lgt11, lgt18-23 và lZAP, là những vector không có hệ thống cho phép chọn lọc dựa
theo các bacteriophage bố mẹ. Số lượng các thể không tái tổ hợp có thể được giảm xuống khoảng 100 lần
bằng cách dùng các nhánh dephosphoryl hóa. Trong hệ thống này, các bacteriophage không tái tổ hợp tạo
thành các plaque màu xanh trên các chủng E. coli thích hợp khi có mặt của IPTG và X-gal, trong khi đó
các plaque tái tổ hợp là không màu.
3. Phân tích các đoạn chèn cDNA
Thu thập khoảng mười hai plaque của bacteriophage tái tổ hợp và chuẩn bị DNA để cắt bằng RE
thích hợp. Phân tích kích thước của các đoạn chèn cDNA bằng điện di trên agarose gel 1%, dùng DNA
marker có các đoạn từ 500 bp tới 5 kb. Nếu các bacteriophage tái tổ hợp chứa các đoạn chèn có kích
thước khác nhau và nếu kích thước trung bình của chúng xấp xỉ 1 kb hoặc lớn hơn, thì có thể tiến hành
các bước tiếp theo (ví dụ: tạo ra thư viện cDNA hoàn chỉnh). Nếu kích thước trung bình của các đoạn
chèn nhỏ hơn 1 kb một cách rõ rệt, thì chất lượng của thư viện là không cao. Trong trường hợp này cần
quay lại phân tích chất lượng của mRNA khởi đầu và các phản ứng tổng hợp cDNA.
4. Tạo thư viện cDNA hoàn chỉnh
Nếu sử dụng các nhánh dephosphoryl hóa để xây dựng thư viện cDNA, thì tính toán lượng cDNA
cho kết quả tăng gấp 10 lần số lượng của các plaque không tái tổ hợp. Nếu sử dụng các nhánh phosphoryl
hóa, thì tính toán lượng cDNA cho kết quả quần thể bacteriophage chứa xấp xỉ 5% các thể tái tổ hợp.
Thiết kế một phản ứng gắn quy mô lớn, tăng số lượng của tất cả các thành phần ở một tỷ lệ thích hợp.
Chắc chắn rằng thiết kế phản ứng gắn đối chứng chỉ chứa các nhánh của bacteriophage l mà không chứa
cDNA. Đóng gói tất cả các hỗn hợp gắn bằng cách thiết kế một chuỗi các phản ứng gắn, mỗi phản ứng
chứa 0,5 mg các nhánh của bacteriophage l. Gộp các tiểu thể đóng gói và xác định độ chuẩn của
bacteriophage gốc trên các chủng vi khuẩn thích hợp.
5. Khuếch đại thư viện cDNA
- Vector lgt10. Để thiết lập một sự cung cấp lâu dài của thư viện, thì nó cần phải được khuếch đại
bằng sự sinh trưởng trên chủng E. coli thích hợp (chẳng hạn chủng BNN102) trên đĩa agar. Nếu thư viện
chỉ được sàng lọc một lần, bước khuếch đại này có thể bỏ qua và các bacteriophage có thể được dàn
mỏng trực tiếp trên chủng BNN102 ở một mật độ tối ưu để tiến hành sàng lọc.
- Vector lgt11 và các dẫn xuất của nó và lZAP, lZAPII. Các thư viện cDNA được xây dựng trong
các vector biểu hiện lgt11, lgt18, lgt20 và lgt22 phải được khuếch đại trên chủng E. coli Y1090hsdR (hoặc
nếu là vector lZAP thì trên chủng BB4, vector lZAPII thì trên chủng XL1-Blue). Các chủng này là không
hoàn hảo cho sự cắt hạn chế kiểm soát vật chủ nhưng lại mang một hệ thống methyl hóa hoạt động. Các vị
trí tiềm tàng cho phản ứng cắt hạn chế bằng hệ thống EcoK sẽ được methyl hóa trong suốt quá trình
khuếch đại sao cho, nếu cần thiết, các thể tái tổ hợp có thể được dùng để gây nhiễm chủng E. coli khả
biến-cắt hạn chế. Trong suốt quá trình khuếch đại, điều quan trọng là ức chế sản xuất các protein độc tố
tiềm tàng bới các bacteriophage tái tổ hợp.
Tài liệu tham khảo/đọc thêm
1. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. 2002. Short
Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA.
2. Brown TA. 2001. Gene Cloning-An Introduction. 4th ed. Blackwell Science, Oxford, UK.
3. Calladine CR and Drew HR. 1997. Understanding DNA: The Molecule and How It Works. 2nd ed.
Academic Press, London, UK.
4. Glick BR and Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of
Recombinant DNA. 3rd ed. ASM Press, USA.
5. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 1989. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. Cold Spring
Habor Laboratory Press, USA.
6. Ohman DE. 1989. Experiments in Gene Manipulation. Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey,
USA.
7. Primrose SB, Twyman R and Old RW. 2001. Principles of Gene Manipulation. 6th ed. Blackwell
Science, Oxford, UK.
8. Rapley R and Walker JM. 1998. Molecular Biomethods Handbook. Humana Press Inc. New Jersey,
USA.
9. Surzycki S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Germany.
1
Vòng cặp tóc: hình dạng của phân tử DNA hoặc RNA được dùng làm mồi cho quá trình tổng hợp sợi thứ hai.
2
cI repressor: gen ức chế có sản phẩm protein liên kết với vùng operator hoặc promoter của gen và kìm hãm phiên
mã bằng cách ngăn chặn sự liên kết của RNA polymerase.
