Thí nghiệm Sinh học phân tử -1- Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
BÀI 1:
MỞ ĐẦU
U^ ! ^
1.CÁC THIẾT BỊ CƠ BẢN CỦA MỘT PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ
BÀO THỰC VẬT
a. Phòng rửa và cất nước
- Máy cất nước 1 lần
- Máy cất nước 2 lần
b. Phòng hấp – sấy
- Autoclave
- Tủ sấy 60 – 200oC
c. Phòng chuẩn bị môi trường
- Cân phân tích (chính xác đến 0,0001 g)
- Cân kỹ thuật (chính xác đến 0,01 g)
- pH kế
- Máy khuấy từ
- Tủ lạnh
- Lò vi sóng (microwave)
d. Phòng thao tác nuôi cấy
- Tủ cấy vô trùng (laminar)
- Quạt thông gió
- Đèn tử ngoại treo tường
e. Phòng nuôi cây
- Các giàn kệ có gắn đèn huỳnh quang
- Máy điều hòa nhiệt độ
- Máy lắc nằm ngang
- Tủ ấm
f. Phòng thí nghiệm:
(phòng này dùng để tiến hành các phân tích sinh hóa, phân tử và di truyền)
- Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần)
- Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần)
- Microtome
- Máy ảnh kỹ thuật số
- Hệ thống đèn chiếu
- Quang phổ kế …
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam -1- Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử -2- Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
2.CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BẢO THÀNH CÔNG TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC
VẬT
Có 3 nhân tố chính:
- Bảo đảm điều kiện vô trùng
- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách
- Chọn mô cấy và xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.
2.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, vitamin, muối khoáng…
rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi
khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm
một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì chỉ
sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một
hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong điều kiện này mô nuôi cấy
sẽ không phát triển và chết dần.
2.2 Nguồn tạp nhiễm
Có 3 nguồn tạp nhiễm chính:
- Dụng cụ thuỷ tinh, môi trường nuôi cấy và nút đậy không được vô
trùng tuyệt đối
- Trên bề mặt hoặc bên trong mô cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử nấm
hoặc vi khuẩn
- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên bề
mặt môi trường
2.3 Kỹ thuật vô trùng
2.3.1 Vô trùng dụng cụ thuỷ tinh, nút đậy và môi trường
a. Dụng cụ thuỷ tinh
Thông thường các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm thường được xử lý bằng
dung dịch sulfocromate một lần đầu trước khi đưa vào sử dụng; về sau chỉ cần rửa sạch
bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước cất và để thật ráo trước khi sử dụng.
Trong trường hợp các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào
thực vật đòi hỏi vô trùng, có thể khử trùng trong tủ sấy ở nhiệt độ cao trong nhiều phút hoặc
nhiều giờ. Các dụng cụ này luôn được gói trong giấy nhôm hoặc hộp kim loại để tránh bị
nhiễm trở lại sau khi đã khử
trùng.
Bảng 1.1: Thời gian khử trùng dụng cụ thuỷ tinh bằng nhiệt và nhiệt đ khử ộ
trùng
Nhiệt độ (oC) Thời gian khử trùng(phút)
160 45
170 18
180 7,5
190 1,5
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam -2- Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử -3- Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
b. Nút đậy
Thường dùng nhất là các nút đậy làm bằng bông gòn không thấm nước.Nút phải tương
đối chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thời nước từ môi trường không bị bốc
hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông không thấm nước là loại nút đơn giản nhất
nhưng có các nhược điểm sau:
- Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ rất dễ bị nhiễm nấm,
nhất là với những thí nghiệm tiến hành trong một thời gian dài
- Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên qui
mô lớn
- Chỉ dùng được vài lần là phải bỏ
Hiện nay người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay thế nút bông. Các hãng sản xuất
dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm và bình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt
có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C mà không bị biến dạng. Một số phòng thí nghiệm dùng
nắp ống nghiệm bằng
inox hoặc cao su rất thuận tiện cho việc vô trùng khô hoặc ướt. Cũng có thể sử dụng giấy
nhôm để làm nắp đậy…
c. Môi trường
Môi trường nuôi cấy thường được hấp khử trùng trong nồi hấp (autoclave), khử trùng
bằng áp suất hơi nước bão hòa. Thời gian hấp từ 15-30 phút ở áp suất hơi nước bão hòa là
103,4 kPa (1atm) tương đương với nhiệt độ 1210C. Ở nhiệt độ 1210C, hầu hết các sinh vật
có trong môi trường đều bị tiêu diệt, kể cả ở dạng bào tử. Sau khi vô trùng cần phải làm khô
nắp ống nghiệm hoặc nút bông để tránh bị nhiễm trở lại.
Bảng 2: Thời gian khử trùng dung dịch và các môi trường lỏng bằng
nồi hấp (autoclave) ở 121oC tại 103,4 kPa
Thể tích môi trường (mL) Thời gian hấp khử trùng(phút)
Thí nghiệm Sinh học phân tử -4- Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
15-20 phút. Đồng thời cũng hấp vô trùng một bình huỷ tinh để hứng dịch lọc. Dùng ống tiêm
hút dịch lọc và bơm qua bộ lọc.
2.3.2 Khử trùng mô thực vật
Mô cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi, noãn,
đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ…tuỳ theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài, các bộ phận này
chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Đòng lúa non khi còn trong bẹ, mô thịt bên trong quả…
thường ít bị nhiễm vi sinh vật; ngược lại, lá, thân đặc biệt ở các bộ phận nằm sâu trong đất
như rễ, củ… có lượng nấm, khuẩn tạp rất cao. Hầu như không thể vô trùng mô cấy được
nếu nấm, khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong mô chứ không hạn chế ở bề mặt. Lá khoai
lang có thể vô trùng dễ dàng trong mùa khô nhưng không thể làm được trong mùa mưa.
Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học có hoạt
tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử
lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy,
khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng
xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô cấy trong vòng 30s trong
rượu ethylic 70% sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn. Đồng thời người ta thêm các chất
giảm sức căng bề mặt như Tween 80, Fotoflo, Teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn. Để có
khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy, xin
dẫn tài liệu nghiên cứu của Street (1974) ở bảng sau:
Tác nhân vô trùng Nồng độ % Thời gian xử lý Hiệu quả
( phút)
Calci hypochlorit 9 – 10 5 – 30 Rất tốt
Natri hypochlorit 2 5 – 30 Rất tốt
Hydro peroxid 10 – 12 5 – 15 Tốt
Nước Brom 1-2 2 – 10 Rất tốt
HgCl2 0.1 – 1 2 – 10 Trung bình
Chất kháng sinh 4 – 50 mg/l 30 – 60 Khá tốt
Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với
các bộ phận có nhiều bụi cát, trước khi xử lý nên rửa cẩn thận bằng nước xà phòng bột và
rửa sạch lại bằng nước máy. Khi xử lý xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô
trùng (tối thiểu là 3 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần
phải được cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh hưởng của tác nhân vô
trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn.
Lớp ngoài cùng này sẽ được lột bỏ đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Vô trùng mô cấy
là một thao tác khó, ít khi thành công ngay từ lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được
nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chăn sẽ đạt kết quả. Có thể
dùng kháng sinh để kiểm soát hoặc loại bỏ sự nhiễm nấm trên mô cấy. Hầu hết các kháng
sinh nhạy cảm với nhiệt do đó không thể hấp vô trùng. Chúng hoà tan được trong nước hoặc
dung môi thích hợp khác, lọc vô trùng và thêm vào môi trường vô trùng khi môi trường này
đã được làm nguội còn 45-50oC. Không phải tất cả các kháng sinh đều thích hợp cho sử dụng
trong nuôi cấy mô thực vật. Các kháng sinh như Streptomycin, Kanamycin và Neomycin
thường độc cho mô thực vật và không hoạt động tốt trong một phạm vi pH nhất định.
Tetracylin cũng là độc tố thực vật, có khuynh hướng ức chế sự tăng trưởng của mô thực vật
sau khi bị xử lý trong một thời giandài. Chloramphenicol có phổ hoạt động rộng nhưng độc
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam -4- Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử -5- Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
cho thực vật (và người) ở nồng độ thấp. Các kháng sinh thường được dùng trong nuôi cấy
mô thực vật gồm Rifampicin (thường được dùng kết hợp với các kháng sinh khác), các
polymicin và vancomycin.
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam -5- Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử -6- Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
Các loại kháng sinh Khả năng hoạt động
Aminoglycoside
- Streptomycin Ức chế sự sinh tổng hợp protein bằng
- Kanamycin cách tác động lên các ribosome 30S hoặc 50S
- Neomycin
Quinolone
- Nalidixic acid Gây trở ngại cho quá trình sao chép DNA
- Ofloxacin bằng cách ức chế enzym DNA gyrase
- Norfloxacin
β-Lactam
- Penicillin Ức chế sự tổng hợp vách tế bào vi khuẩn
- Ampicillin
- Carbenicillin
Tetracyclin Ức chế sinh tổng hợp protein bằng cách
tác động lên ribosome 30S
Trimehtoprim và sulphonamide Ức chế sự sinh tổng hợptetrahydrofolate
Chloramphenicol Ức chế sự sinh tổng hợp protein bằng
cách tác động lên Rbx 50S
Macrolide và lincosamide
- Erythromycin Ức chế sự sinh tổng hợp protein bằng
-Lincomycin cách tác động lên Rbx 50S
Glycopeptide Tác động lên sự sinh tổng hợp vách tế bào
- Vancomycin vi khuẩn.
Polymixin Gắn lên màng tế bào làm thay đổi dòng
- Polymixin B ion dẫn đến sự phá vỡ tế bào
- PolymicinE
Rifampicin Tác động lên RNA bằng cách gắn vào
RNA polymerase
2.3.3 Kỹ thuật cấy vô trùng
Để tránh bị nhiễm trong suốt thao tác cấy mô thực vật, các nhà khoa học làm việc trong tủ
cấy vô trùng (laminar). Đó là các tủ cấy có thiết bị thổi không khí đã lọc vô trùng vào chỗ thao
tác cấy. Tủ cấy vô trùng loại trừ một cách hiệu quả nguồn tạp nhiễm từ bên ngoài và tạo điều
kiện thoải mái chongười cấy, nên hiện nay được sử dụng rất phổ biếân trong các phòng thí
nghiệm. Không khí từ bên ngoài được quạt hút vào qua một màng lọc thô. 99% bụi trong không
khí được giữ lại ở màng lọc thô. Sau đó không khí được thổi qua màng lọc tinh và phân phối
đều ra khắp bề mặt của tủ cấy, không tạo những xoáy không khí đưa bụi vào chỗ cấy. Màng
lọc tinh ngăn cản các phần tử lớn hơn 0.3micron với hiệu quả 99,99% và do các hãng chuyên
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam -6- Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử -7- Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
sản xuất màng lọc cung cấp. Tuổi thọ của màng lọc thô tuỳ theo số lượng bụi nơi làm việc,
thường từ 6 tháng đến 1 năm và của màng lọc tinh từ 2 đến 3 năm. Khi thấy hiệu quả vô trùng
của tủ cấy laminar kém đi thì cần phải thay màng lọc mới. Để kéo dài tuổi thọ của bộ màng lọc
trong tủ cấy laminar- thường rất đắt tiền - nên bố trí tủ cấy trong các phòng riêng, càng ít bụi
càng tốt.
2.3.4 Khử trùng nơi thao tác cấy và dụng cụ cấy
Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thuỷ tinh chứa
môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy. Người ta áp dụng nhiều biện pháp
khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp này. Phòng cấy thường là buồng có diện tích hẹp,
rộng từ 10-15m2, có hai lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi
vào. Sàn và tường lát gạch men để có thể lau chùi thường xuyên. Trước khi đưa vào sử dụng,
phòng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cách rót formaldehyde (formalin) 4% ra một số nắp
đĩa petri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24h,
sau đó bỏ formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde còn thừa bằng dung dịch NH3 25% cũng
trong 24h. Bề mặt nơi chuẩn bị cấy, bề mặt bên trong và ngoài tủ cấy phải được khử trùng
trước khi cấy bằng cách lau sạch các bề mặt này bằng cồn 90%. Tia UV cũng có thể được sử
dụng để khử trùng bề mặt phòng cấy và tủ cấy nhưng nó ít hiệu quả hơn và nguy hiểm hơn là
sử dụng cồn. Tia UV chỉ tiêu diệt được các mầm vi sinh nằm trực tiếp ngay trên các bề mặt mà
tia này chiếu vào; nhưng nó không thể thấm qua các lớp bụi để tiêu diệt các vi sinh vật nằm bên
dưới các lớp bụi này. Tia UV còn gây hại cho mắt và gây ung thư da. Các dụng cụ mang vào
phòng cấy đều vô trùng trước: từ áo choàng, mủ vải, khẩu trang của người cấy đến dao, kéo,
kẹp (forceps), giấy lọc, bình đựng nước cất... Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn để sử
dụng trong khi cấy và một cốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc. Trước khi cấy,
người cấy cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến khuỷu tay bằng cồn 90%. Để đảm bảo
mức độ vô trùng cao trong phòng cấy ần có một đèn tử ngoại 40W treo trần. Chỉ cho đèn này
làm việc khi không có người trong phòng cấy. Nên bật đèn tử ngoại 30 phút trước khi cấy. Cần
giảm sự chuyển động của không khí trong phòng cấy đến mức tối thiểu, vì vậy tất cả các dụng
cụ phục vụ cho việc cấy đều phải chuẩn bị đầy đủ để trong thời gian cấy tránh đi lại ra vào
phòng cấy quá nhiều. Các dụng cụ bằng kim loại như kẹp cấy, dao mổ, que cấy vòng, kim mũi
nhọn có thể được khử trùng bằng cách đốt dưới ngọn lửa đèn cồn. Những dụng cụ này trước
hết phải được nhúng vào cồn tuyệt đối rồi mới đốt. Nhớ để ráo đi các giọt cồn thừa rồi mới
đưa vào ngọn lửa đèn cồn. Khi mở nắp chai hoặc nắp ống nghiệm môi trường nuôi cấy, thì
dùng ngón tay kế út và ngón tay út cầm lấy nắp gòn, và không chạm tay vào bề mặt bên trong
của nắp gòn cũng như không thả nắp gòn xuống bất cứ bề mặt nào cho đến khi gắn nó trở lại
chai môi trường.
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam -7- Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử -8- Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
BÀI 2:
KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG
Ờ^ ! ^
1.VẤN ĐỀ LỰA CHỌN MÔI TRƯỜNG
Khi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào đối với một số đối tượng nhất định, vấn đề đặt ra là
chọn môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỷ lệ các chất dinh dưỡng. Cách thường làm
là qua các tài liệu đã xuất bản, các công trình đã nghiên cứu về đối tượng đó hoặc cùng họ
tương đương xem các tác giả đã sử dụng môi trường loại nào. Bước đầu có thể giữ nguyên môi
trường của tác giả đó hoặc trên cơ sở đó mà cải tiến cho phù hợp qua các thí nghiệm thăm dò.
Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, nhiều
mục đích nuôi cấy khác nhau. Về cơ bản có thể chia ra làm 3 loại:
- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là môi truờng White,Knop và Knudson C …
- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: điển hình làmôi trường B5 của
Gamborg …
- Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình là môi trường MS (Murashige-Skoog)…
Vì vậy khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, chưa có tài liệu trước thì
nên thăm dò so sánh 3 loại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu phù hợp với loại môi
trường nào nhất. Sau đó cần thử tìm tỉ lệ NO3/ NH4+ thích hợp. Các tác giả phương Tây làm việc
với cây trồng cạn thường không đưa NH4+ vào môi trường. Nhưng đối với những cây dinh
dưỡng NH4+ mạnh như cây lúa, việc thêm vào môi trường nuôi cấy một tỉ lệ NH4+ thích hợp
chắc chắn sẽ có lợi. Việc sử dụng mang tính kinh nghiệm chủ nghĩa đối với một số môi trường
đã cản trở khá nhiều sự tiến bộ của công tác ở một số phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật.
Thuốc lá và carốt là 2 loại cây kinh điển của
nuôi cấy mô thực vật. Môi trường nuôi cấy 2 loại cây này đã được xây dựng khá hoàn chỉnh.
Tuy vậy, không thể dùng nguyên các môi trường đó để nghiên cứu các cây hoà thảo hoặc các
cây họ đậu mà không có sự cải tiến, sửa đổi. Điều này giải thích sự tiến bộ chậm chạp của
nuôi cấy mô một số cây hoà thảo so với cây 2 lá mầm.
Hiện nay, môi trường MS được coi như là môi trường thích hợp với nhiều loại cây do giàu và
cân bằng về mặt dinh dưỡng. Vì vậy, những người tập sự làm nuôi cấy mô thường bắt đầu với
môi trường này trước khi tìm được môi trường của riêng mình.
2.CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG
Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy người ta không cân hoá chất mỗi lần
pha mà thường chuẩn bị trước dưới dạng các dung dịch đậm đặc (còn gọi là các stock), sau đó
chỉ cần pha loãng khi sử dụng. Các stock này thường được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh
thường hoặc tủ lạnh sâu.
2.1 Thành phần môi trường dinh dưỡng
Nước cất
Chất hữu cơ - Đường- Acid amin- Vitamin (B1, B6, H, PP…)- Các chất điều hòa sinh trưởng
thực vật (Auxin, Cytokinin,Gibberellin…)
Chất vô cơ
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam -8- Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử -9- Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
Đa lượng N P K Ca Mg S
Vi l ư ợng Fe Zn B Co N Mn Cu Al Mo I
Các hợp chất không biết rõ thành phần
Nước dừa, nước khoai tây, nước chuối, casein,hydrolysalt, trypton, pepton…
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam -9- Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử - 10 - Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠ BẢN CỦA MÔI TRƯỜNG MS
(Murashige và Skoog, 1962)
SKOOG I SKOOG II SKOOG III
NH4NO3 FeSO4.7H2O KI
1650 mg/L 27,8 mg/L 0,83 mg/L
KNO3 MnSO4 Na2MoO4.2H2O
1900 mg/L .4H2O 0,25 mg/L
KH2PO4 22,3 mg/L CuSO4.5H2O
170 mg/L H3BO3 0,025 mg/L
MgSO4.7H2O 6,2 mg/L CoCl2.6H2O
370 mg/L ZnSO4.7H2O 0,025 mg/L
CaCl2.2H2 8,6 mg/L
440 mg/L
Na2EDTA
37,3 mg/L
THÀNHPHẦN VITAMIN CỦA MOREL
Morel’sVitamin
Pirydox Biotin Meso- Nicotini Thiami Pantotat
ine (B6) (H) inositol c acid n –HCl e Calci
1 mg/L 0,01 100 mg/ (P.P) (B1) 1 mg/L
mg/L L 1 mg/L 1 mg/L
2.2 Cách pha các dung dịch mẹ (stock)
* Stock đa lượng MS : SKOOG I (x10)
(Pha thành 1Lvới nồng độ sử dụng khi pha 1Lmôi trường MS là 100mL/L)
NH4NO3 KH2PO4 CaCl2.2H2O
16500 mg 1700 mg 4400 mg
KNO3 MgSO4.7H2O
19000 mg 3700 mg
Cân và dùng nước cất hoà tan lần lượt từng chất trong bécher cho
tan hoàn toàn. Dùng ống đong 1L điều chỉnh cho đủ 1 lít.
* Stock sắt MS: SKOOG II (x100)
(Pha thành 200mL với nồng độ sử dụng khi pha 1L mội trường MS là 2mL/L)
Na2EDTA FeSO4.7H2O
3730 mg 2780 mg
Cân và hoà tan từng chất bằng 100mL nước cất trong mỗi bécher riêng.
Đặt 2 bécher dung dịch lên bếp và gia nhiệt cho dung dịch ấm lên vừa có hơi
nóng bốc lên là được. Khuấy đều và đổ dung dịch Na2EDTA vào ống đong
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 10 - Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử - 11 - Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
200 mL, rồi cho từ từ dung dịch FeSO4vào, vừa cho vừa khuấy đều. Để nguộI rồi cho vào
bình tối bảo quản trong tủ lạnh.
* Stock vi lượng MS: SKOOG III (x100)
Trước tiên cần chuẩn bị các stock con:
Dung dịch KI: (83mg/mL)
Cân 8300 mg KI hoà tan với nước cất cho đủ 100mL
Dung dịch Na2MoO4.2H2O: (25mg/mL)
Cân 2500mg Na2MoO4.2H2O hoà tan với nước cất cho đủ 100mL
Dung dịch CuSO4.5H2O (2,5mg/mL)
Cân 250mg CuSO4.5H2O hòa tan với nước cất cho đủ 100mL
Dung dịch CoCl2.6H2O (2,5 mg/mL)
Cân 250 mg CoCl2.5H2O hòa tan với nước cất cho đủ 100 mL
SKOOG III (x100): pha thành 500mL với nồng độ sử dụng khi pha 1L môi trường MS
là 5mL/L
MnSO4.4H2O KI
2230 mg 83 mg/1 mL
H3BO3 Na2MoO4.2H2O
620 mg 25 mg/1 mL
ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O
860 mg 2,5 mg/1 mL
CoCl2.6H2O
2,5 mg/1 mL
Cân 3 chất đầu tiên và hoà tan với nước cất trong từng bécher riêng.Cho từng dung dịch theo
thứ tự vào ống đong 500mL. Sau đó hút 1mL dungdịch trong stock con của 4 chất tiếp theo cho
vào ống đong, vừa cho vừa khuấy đều và thêm nước cất cho đủ 500mL
* Thành phần vitamin
Pha các stock con
Dung dịch pirydoxine (B6) (10mg/mL)
Cân 1000mg B6 hòa tan với nước cất cho đủ 100mL
Dung dịch Biotin (H) (1mg/mL)
Cân 100mg biotin hòa tan với nước cất cho đủ 100 mL
Dung dịch Nicotinic Acid (P.P) (10mg/mL)
Cân 1000 mg nicotinic acid hòa tan với nước cất cho đủ 100mL
Dung dịch Thiamin-HCl (B1) (10mg/mL)
Cân 1000 mg B1 hoà tan với nước cất cho đủ 100 mL
Dung dịch Pantotheate-Ca (10mg/mL)
Cân 1000 mg Pantotheate-Ca hòa tan với nước cất cho đủ 100mL
Vitamin Morel (x 100) Biotin (H)1 mg/1 mL Meso-inosito l10 g/10g
Pirydoxine (B6)100g/10mL
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 11 - Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử - 12 - Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
Nicotinic acid(P.P) Thiamin – Pantotate Calci100 mg/10
100mg/10mL HCl(B1)100mg/10mL mL
Cân meso-inositol rồi hòa tan với nước cất. Đong từng chất theo thứ tự
cho vào ống đong có chứa nước cất , vừa cho vừa khuấy đều và thêm nước
cho đủ 200mL
* Thành phần các chất đều hòa sinh trưởng thực vật (tính theo mg)
i
Dung dịch BAP (1mg/mL)
Cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hoà tan trong 5mL NaOH 1N.Cho thêm nước cất cho
đủ 100 mL. Mỗi mL dung dịch có chứa 1mg BAP
Dung dịch IAA (1mg/mL) Cân 100mg Indolacetic acid (IAA) hòa tan trong 5 mL NaOH 1N.
Cho thêm nước cất cho đủ 100mL. Mỗi mL dung dịch có chứa 1mg IAA.
Dung dịch IBA (1mg/mL) Cân 100mg Indolebutyric acid (IBA) hòa tan trong 5mL NaOH 1N.
Cho thêm nước cất cho đủ 100mL. Mỗi mL dung dịch có chứa 1mg IBA
Dung dịch Kinetin (1mg/mL) Cân 100mg Kinetin (KIN) hòa tan trong 5 mL NaOH 1N. Cho
thêm
nước cất cho đủ 100mL. Mỗi mL dung dịch có chứa 1mg KIN. Dung dịch NAA ( 1mg/mL)
Cân 100mg Naphthaleneacetic acid (NAA) hòa tan trong 5mL NaOH 1N. Cho thêm nước cất
cho đủ 100mL. Mỗi mL dung dịch có chứa 1mg NAA.
Dung dịch 2,4-D (1mg/mL)Cân 100mg 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) hòa tan trong
50mL ethanol 50%. Cho thêm nước cất cho đủ 100mL. Mỗi mL dung dịch cóchứa 1mg 2,4-D.
* Các dung dịch chất đều hòa sinh trưởng thực vật (tính bằng mol/l)
i
BAP có trọng lượng phân tử (MW) là 225.26
- Hoà tan 225.26gr BAP trong 1l nước cất tức ta có 1l dung dịch BAP1M hay 1mol/l
- Cân 225.26 mg BAP hoà tan trong 1l nước cất tức ta có 1l dung dịch BAP 1mM hay 1mmol/l
- Cân 225.26x10-3 mg BAP hoà tan trong 1l nước cất tức ta có 1l dung dịch BAP 1µM hay
1µmol/l Dung dịch BAP ( MW 225.26) (10mM)
Cân 225.26 mg BAP hoà tan trong 5 mL NaOH 1N. cho thêm nước cất cho đủ 100 mL , tức ta
có 100 mL dung dịch BAP 10mM
Ví dụ: Cho 1mL dung dịch BAP 10mM vào môi trường MS để pha được 1L môi trường. Như
vậy ta có 1L môi trường MS có chứa 10µM BAP. Muốn pha 1Lmôi trường MS có chứa 1µM
BAP, ta sử dụng 0.1mL dung dịch BAP 10 mM.
Tương tự như vậy pha cho các loại kích thích tố còn lại, biết:
- IAA (MW 175.19) - NAA (MW 186.21)
- IBA (MW 203.24) - 2,4-D (MW 221.04)
- Kinetin (MW 215.22)
3. THỰC HÀNH
- Tiến hành pha Skoog I, II và III của môi trường MS
- Pha stock vitamin Morel, glycin và inosytol
- Pha các stock chất điều hoà sinh trưởng như đã hướng dẫn phần trên
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 12 - Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử - 13 - Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
BÀI 3:
GIEO HẠT IN-VITRO
I ^!^
I.CHỌN MÔ CẤY VÀ XỬ LÝ MÔ CẤY
1.1 Chọn lựa mô cấy
Không có những hướng dẫn cụ thể trong việc chọn mô cấy. Về nguyên tắc, trừ những mô
cấy đã hóa gỗ, các mô khác trong cơ thể thực vật đều có thể dùng làm mô cấy. Tuy vậy có thể
nhận xét chung là các mô đang phát triển, thịt quả non, lá non, cuống hoa, đế hoa, mô phân
sinh… khi đặt vào môi trường có chứa một lượng chất sinh trưởng thích hợp đều có khả năng
phân chia và phân hóa. Để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, trước tiên
người ta chú ý đến các chồi nách và mô phân sinh ngọn. Cần biết rằng tuy mang một lượng
thông tin di truyền như nhau, các mô khác nhau trên cùng một cây có thể sinh trưởng và phát
triển với khả năng tái sinh chồi, rễ hay cây hoàn chỉnh rất khác nhau. Vì vậy, khi khởi sự chọn
giống, nhân giống một cây cụ thể bằngphương pháp nuôi cấy môvà tế bào thực vật, trước hết
cần thí nghiệm tìm hiểu phản ứng của các bộ phận khác nhau của cấy trong nuôi cấy ở các
nồng độ chất sinh trưởng khác nhau. Sau khi cấy, mô cấy cần được đặt trong điều kiện nhiệt
độ và ánh sáng ổn định. Tuỳ vào các mục đích nghiên cứu mà có các chế độ chiếu sáng khác
nhau, chẳng hạn quá trình tạo mô sẹo có thể cần bóng tối hay ánh sáng, nhưng quá trình tái sinh
và nhân giống vô tính nhất thiết phải có ánh sáng. Nhiệt độ phòng nuôi nên giữ ổn định 25+2oC
bằng máy điều hòa nhiệt độ. Cường độ chiếu sáng khoảng từ 2000 –3000 lux.
1.2 Xử lý vô trùng mẫu cấy
Mẫu đưa vào nuôi cấy invitro có nhiều nguồn gốc khác nhau. Có thể là những mẫu cấy đã vô
trùng như cây con invitro cho nảy mầm trong điều kiện vô trùng; cũng có thể đó là các mẫu cấy
chưa vô trùng, lấy trực tiếp từ bên ngoài tự nhiên như chồi non, lá, thân, củ, rễ… Thuận lợi
nhất là sử dụng các mẫu cấy đã vô trùng bởi lẽ các phương pháp vô trùng mẫu cấy trực tiếp
thường ít nhiều gây hại cho mẫu cấy do chất khữ trùng gây ra.
Có nhiều phương thức vô trùng mẫu cấy:
a. Vô trùng hạt:
- Rửa hạt bằng xà phòng, lắc đều 2-3 phút. Với các loại hạt nhỏ, thường
đựng hạt trong túi vải mùng.
- Rửa sạch xà phòng bằng nước máy dưới vòi nước chảy mạnh
- Vô trùng sơ bộ bằng cồn 70%, lắc đều 1-2 phút
- Rửa sạch cồn bằng nước vô trùng
- Cho hạt vào dung dịch khử trùng NaOCl 1-15%. Thêm vài giọt bám
dính Tween20. Khử trùng trong 15-20 phút tuỳ mẫu.
- Rửa sạch chất khử trùng nhiều lần bằng nước vô trùng (khoảng 5 lần)
cho đến khi hết mùi javel.
- Hạt vô trùng đã có thể nuôi cấy trên môi trường tạo mẫu vô trùng.
b. Các phương thức khác vô trùng hạt
- Khử trùng lần thứ nhất với NaOCl 5,25%
- Khử trùng lần thứ hai với HgCl2 0,1 –1%, thêm vài giọt HCl 0,5% trong 10 phút.
- Rửa mẫu với H2O2 6% vô trùng trước khi rửa lại bằng nước vô trùng
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 13 - Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử - 14 - Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
- Có thể khử trùng sơ bộ hạt bằng acid sulfuric trong 2-10 phút
- Với hạt có vỏ cứng, có thể dùng phương pháp đốt để khử trùng sơ bộ.
c. Vô trùng chồi non, lá và thân cỏ:
- Vô trùng sơ bộ bằng cách ngâm mẫu vào cồn 70% trong 1-3 phút, thờI gian xử lý này
cũng còn tuỳ thuộc vào độ cứng hay mềm của mẫu
- Vô trùng mẫu với chất khử trùng NaOCl 1% hay với javel thương phẩm theo tỉ lệ 1:4 hay
1:5 trong thời gian 5-20 phút tuỳ theo mẫu
- Rửa lại bằng nước vô trùng cho sạch hoàn toàn chất khử trùng
d. Vô trùng củ, rễ
- Mẫu nuôi cấy phải được rửa dưới vòi nước chảy mạnh cho thật sạch đất cát bám trên
mẫu, sau đó ngâm trong nước xà phòng loãng 10 phút
- Vô trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 1-5 phút
- Vô trùng với chất khử trùng có nồng độ và thời gian thay đổi tuỳ mẫu
- Rửa lại bằng nước vô trùng cho thật sạch chất khử trùng
e. Tránh hoại mẫu
Trong quá trình nuôi cây thường xuất hiện nhiễm là do trong quá trình nuôi cấy đã để bào tử
trong không khí rơi vào hay mẫu cấy chưa được vô trùng hoàn toàn. Sau một thời gian thì bào tử
phát triển nhanh chóng và có thể sẽ làm chết mẫu hoặc cạnh tranh chất dinh dưỡng làm mẫu
không phát triển. Hoại mẫu thường do nấm mốc (khuẩn lạc có dạng sợi) hoặc do khuẩn
(khuẩn lạc có dạng ván nhầy). Nếu nấm hoặc khuẩn chỉ mọc tr6en bề mặt môi trường, đó
thường là nhiễm do thao tác cấy chưa tốt; nếu có khắp trong môi trường là nhiễm do môi
trường chưa được tiệt trùng hoàn toàn; còn nếu khuẩn và nấm xuất phát từ gốc mẫu lan ra thì
đó là do mẫu chưa được khử trùng triệt để. Tuỳ theo quan sát và dựa vào kinh nghiệm của
người cấy mà có nhận định chính xác về nguyên nhân gây hoại mẫu để tìm cách khắc phục tình
trạng này. Trong trường hợp các bình nuôi cấy đã bị nhiễm, cần được hấp bỏ trước khi đem đi
rửa sạch để tránh lây lan nguồn nhiễm trong khu vực cấy.
2.THỰC HÀNH
2.1 Mục đích
Giúp cho sinh viên làm quen với thao tác vô trùng mẫu cấy và kỹ thuật cấy vô trùng
2.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
2.2.1 Dụng cụ:
- Bình tam giác (250mL) - Bécher (cốc đốt thuỷ - Forceps (kẹp), dao cấy,
- Giấy cấy vô trùng tinh) 500mL, 1000mL đèn cồn
- Đĩa petri vô trùng
2.2.2 Thiết bị:
- Autoclave - Tủ lạnh - Máy khuấy từ
- Tủ sấy - Cân kỹ thuật - pH kế
- Tủ cấy (laminar) - Máy cất nước 2 lần
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 14 - Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử - 15 - Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
2.2.3 Hoá chất
- Dung dịch Skoog I, II - Đường saccharose - Dung dịch hypochloride
và III của môi trường MS - Agar calcium 10%
- Stock vitamin Morel - Nước cất vô trùng - Xà phòng bột
- Stock glycin - Cồn 90%, 70%
2.3 Các bước tiến hành
2.3.1 Chuẩn bị môi trường
(thành phần cho 1L môi trường)
- Skoog I (MS):100mL - Glycine: 2mL
- Skoog II (MS): 2mL - Sucrose: 30g
- Skoog III (MS): 5mL - pH :5,8
- Vitamin Morel: 2mL - Agar:7g
2.3.2 Nguyên liệu thực vật:
- Các hạt cam chanh còn nguyên vẹn, không bị hư hại
2.3.3. Các bước thực hiện
- Cho hạt vào bécher có chứa nước xà phòng loãng, rửa hạt cho sạch chất nhớt bám xung
quanh hạt
- Rửa hạt cho sạch xà phòng bằng nước cất. Ngâm hạt 2phút trong cồn 70%
- Rửa hạt sạch etanol bằng nước cất. Sau đó ngâm hạt 10phút trong dung dịch hypochloride
calcium 10%
- Trong tủ cấy vô trùng, rửa hạt cho sạch chất khử trùng bằng cách lắc hạt trong nước cất vô
trùng (3 lần)
- Tiến hành tách áo hạt bằng kẹp và dao mổ vô trùng. Cho các hạt vừa tách bỏ vỏ áo vào đĩa
petri vô trùng có chứa giấy thấm vô trùng và làm ẩm giấy thấm bằng một ít nước cất vô trùng.
- Gieo hạt: gieo 4-5 hạt vào các bình tam giác chứa môi trường nuôi cấy đã được hấp khử
trùng.
- Đậy nắp bình cấy và ghi rõ họ tên, ngày cấy, số nhóm, tên giống và môi trường.
2.4 Yêu cầu
- Thực hiện pha môi trường gieo hạt
- Thực hiện các thao tác vô trùng trong nuôi cấy và kỹ thuật gieo hạt
- Thu được các cây con vô trùng trong ống nghiệm
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 15 - Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử - 16 - Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
BÀI 4:
NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG
N^ ! ^
1.GIỚI THIỆU
Trong nuôi cấy invitro, một phương thức đơn giản và thường hay được sử dụng để tái sinh
chồi invitro là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Hiểu một cách đúng nghĩa thì nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng là sử dụng phần mô phân sinh ngọn với 3-4 tiền phát khởi lá, tức là các đỉnh sinh trưởng
có kích thước từ 0,1 –0,15mm tính từ chóp sinh trưởng. Kỹ thuật này khá phức tạp, phải thực
hiện dưới kính lúp và khả năng sống sót của mẫu cấy có kích thước nhỏ như thế thường không
cao, do đó chỉ được tiến hành khi cần nuôi cấy với mục đích tạo các cây con invitro sạch virus.
Trên thực tế người ta thường nuôi cả đỉnh chồi non với kích thước khoảng vài mm. Đó có
thể là đỉnh chồi ngọn hoặc đỉnh chồi nách. Mỗi đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích
hợp sẽ tạo ra một hay
nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triễn thành cây hoàn chỉnh. Xét về nguồn gốc của các cây đó,
có thể có ba khả năng:
- Cây phát triễn từ chồi ngọn
- Cây phát triễn từ chồi nách phá ngủ
- Cây phát triễn từ chồi mới phát sinh, ví dụ: nuôi cấy đoạn trụ hạ diệp của cây mãng cầu
(Annona squamosa) sẽ cho rất nhiều mầm (buds) trên mô cấy và một số mầm sau đó sẽ phát
triễn thành chồi và sau đó sẽ thành cây invitro hoàn chỉnh. Tuy nhiên thông thường rất khó phân
biệt chồi phá ngủ và chối mới phát sinh. Các phương thức phát triễn cây hoàn chỉnh từ đỉnh sinh
trưởng nuôi cấy như sau:
* Phát triễn cây trực tiếp:
Chủ yếu ở các đối tượng hai lá mầm (dicotyledon) như khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa
cúc… Ví dụ: Khoai tây (Solanum tuberosum):
Mầm (đỉnh sinh trưởng) → Chồi nách → Cây
* Phát triển cây thông qua giai đoạn protocorm
Chủ yếu gặp ở các dối tượng một lá mầm (monocotyledon) như phong lan, dứa, huệ… Cùng
một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm (proembryo) và các protocorm này có thể tiếp
tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh. Bằng phương thức
này trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được hàng triệu cá thể
Ví dụ:Hoa lan (Orchidaceae):
Đỉnh sinh trưởng → Protocorm → Cây
Theo Champagnat (1977) và Fast (1980), các chồi non đang tăng trưởng dài 10-15cm, cừa mới
nhú lá thường được dùng làm vật liệu cho việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Đất bẩn được dội
sách đưới vòi nước chảy và là được lột sách cho đến khi thấy rõ các chồi bên. Chồi non lúc này
được nhúng vào cồn 70% và được khử trùng trong dung dịch khử trùng 10%(v/v). Các chồi bên
được lấy ra và rửa trong nước cất vô trùng. Sau đó, chúng được khử lại thêm 10 phút nữa trong
dung dịch khử trùng 3% có chứa Tween80 và được rửa lại trong nước cất vô trùng. Trong tủ cấy
vô trùng, phần gốc của những
chồi nhỏ nhất được cắt bỏ và việc cấy được tiến hành. Trên các chồi lớn hơn, trước hết
tách bỏ các lá và phần gốc bị chết do tác động của chất khử trùng, sau đó cấy vào môi trường.
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 16 - Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử - 17 - Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
Phải mất một thời gian tương đối dài thì protocorm mới được thành lập. Các protocorm này
được cắt ra và cấy chuyền vào môi trường mới. Ngày nay, người ta thường cấy các đỉnh chồi
lớn hơn (mang 3-4 tiền phát khởi lá) vì dễ thành công hơn là cấy các đỉnh chồi chỉ có 2 tiền phát
khởi lá. Nếu protocorm không được cắt khỏi mẫu cấy thì nó phát triễn thành cồi và ra rễ; nếu
được tách ra khỏi mẫu cấy thì sẽ có sự thành lập các protocorm bất định mới từ các peotocorm
ban đầu.
Khi cấy đỉnh sinh trưởng của Cymbidium chỉ có vùng xung quanh tiền phát khởi lá u lên và
cuối cùng tạo thành protocorm. Sự thành lập protocorm có thể được tạo ra mà không cần có
đỉnh sinh trưởng ngọn. Khi cấy đỉnh sinh trưởng của Cattleya, các mô thường nhanh chóng hoá
nâu. Vì lý do đó mà đỉnh sinh trưởng được cắt trong môi trường lỏng hoặc nước cất vô trùng và
được vấy trong môi trường lỏng, nhờ đó các chất nâu dễ khuyếch tán vào trong môi trường và ít
gây ảnh hưởng đến mô cấy (Fast, 1980). Ở Cattleya, người ta thường tách một chồi (3-5mm)
với nhiều tiến phát khởi lá. Môi trường cấy Cattleya thường phức tạp hơn môi trường cấy
Cymbidium (Fast, 1980 và Champanat,1977) đôi khi có chứa auxin, cytokinin, nước dừa và
peptone. Sự thành lập protocorm ở Cattleya mất nhiều thời gian và luôn được tạo ra ở phần gốc
của lá già nhất; thực tế đỉnh sinh trưởng ngọn không đóng vai trò gì cả và mất đi. Việc cấy các
tiền phát khởi lá Cattleya cũng có thể đáp ứng cho sự thành lập protocorm.
Môi trường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tương đối đơngiản và rất giống môi trường gieo hạt
cho nhiều giống lan káhc nhau. Cymbidium thường được nuôi cấy trên môi trường khoáng
Knudson C hoặc Vacin & Went Đỉnh sinh trưởng thường được cấy trên môi trường đặc (ngoại
trừ Cattleya)nhưng protocorm thường được nhân lên trong môi trường lỏng, và protocorm chỉ
tăng trưởng thành chồi con khi được cấy trên môi trường đặc, thành phần môi trường thường
khác nhau trong từng giai đoạn. Môi trường có pH trong khoảng từ 4,8 –5,8. Nồng độ đường
saccharose từ 1-3% (w/v) hoặc đôi khi là 1,5% glucose + 1,5% fructose. Một số loài lan đơn thân
thì không cần đường trong giai đoạn nuôi cấy đỉnh sinh trưởng vì sự hiện diện của đường có
thể làm đỉnh sinh trưởng và và chết. Trong giai đoạn tạo protocorm, thường đường và nước dừa
(!0-15%) được thêm vào môi trường để kích thích sự thành lập protocorm. Chất điều hoà sinh
trưởng thực vật nói chung không cần thiết, sự hiện diện của chúng trong môi trường có thể làm
cơ hội cho đột biến lớn hơn. Nhiệt độ tối ưu cho nhân giống từ 22-28oC.
Ánh sáng đèn huỳnh quang thường được sử dụng với 12-16 giờ chiếu sáng/ngày. Có thể
nuôi cấy ở cường độ chiếu sáng thấp nhưng cần gia tăng ánh sáng trong giai đoạn tạo chồi từ
protocorm. Nói chung có thể thực hiện việc nhân giống lan từ đỉnh sinh trưởng theo 2 cách:
hoặc trên môi trường đặc hoặc trên môi trường lỏng. Trong môi trường lỏng cần lắc vòng với
vận tốc rất khác nhau tuỳ theo loài nhưng hầu hết các nhà nghiên cứu thường thực hiện với vận
tốc thấp 2-5 vòng/phút. Sự nhân giống trong môi trường lỏng thường tốt hơn trên môi trường
đặc bởi vì khi lắc sẽ cung cấp O2 và chất dinh dưỡng cho mẫu cấy hiệu quả hơn. Khi cây con
cao khoảng 5-7cm với 3-4 lá có thể mang ra trồng trong vườn ươm.
Các đối tượng hoa lan đã mang lại hiệu quả kinh tế đặc biệt cao. Sau những kết quả đầu
tiên ở chi Cymbidium của Morel (1966) người ta đã thu được kết quả rất tốt ở 22 chi khác nhau
của họ này. Sở dĩ nhân giống vô tính hoa lan đạt được thành công lớn và được ứng dụng rộng
rãi như vậy là vì hoa lan có phương thức sinh sản qua protocorm. Nhờ có phương thức nhân
giống nhanh và rẻ tiền mà hoa lan vốn đắt trở nên có giá cả phải chăng và được nhiều người ưa
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 17 - Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử - 18 - Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
chuộng. Những thành công ở họ Lan không những chỉ là bằng chứng mà còn mở đường cho
việc ứng dụng kỹ thuật này đối với các loài cây khác.
2.THỰC HÀNH
2.1 Mục đích
- Khử trùng mẫu đỉnh chồi
- khảo sát sự tái sinh cây trực tiếp từ nuôi cấy đỉnh chồi
- Khảo sát sự thành lập protocorm từ nuôi cấy đỉnh chồi
2.2 Nuôi cấy phát triễn thành cây trực tiếp
2.2.1 Nguyên vật liệu
Đoạn thân non cây cam hoặc chanh
2.2.2 Môi trường nuôi cấy
Môi trường MS bổ sung BA 2ppm và NAA 0,2ppm
2.2.3 Tiến hành:
- Các cành mẫu non lấy từ vườn ươm về được cắt bỏ hết lá, cắt thành đoạn 2-3cm, cho vào
bécher
- Rửa sạch cành mẫu bằng nước xà phòng loãng, sau đó rửa sạch xà phòng bằng nước máy
nhiều lần dưới vòi nước chảy mạnh.
- Đưa cành mẫu vào tủ cấy vô trùng, ngâm trong cồn 70% trong 2-3 phút
- Rửa sạch cồn bằng nước cất vô trùng 1 lần
- Xử lý mẫu bằng Ca(OCl)2 6% trong 10 phút sau đó thay bằng dung dịch Ca(OCl)2 5% trong 5
phút
- Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 6-7 lần cho hết mùi javel
- Cành mẫu được cắt bỏ cuống lá và 2 đầu của phần thân đã bị chất khử trùng tẩy trắng.
Chia cành mẩu thành các đốt 1cm
- Cắm các đốt vào môi trường nuôi cấy đã chuẩn bị, cho phần cuống lá hướng lên trên, chồi
ngủ phải nằm trên mặt thoáng của môi trường.
- Nuôi mẫu trong điều kiện sáng 2000lux/16h/ngày ở 25oC.
2.3 Nuôi cấy phát triễn cây thông qua giai đoạn protocorm
2.3.1 Nguyên vật liệu
Các đoạn chồi con Dendrobium cao 10cm
2.3.2 Môi trường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (cho 1L môi trường)
- Khoáng đa lượng Knudson - Vitamin Morel: 2mL - Nước dừa: 150mL
100mL - Glycin :2mL - Khoai tây: 60g
- Khoáng vi lượng Heller - Inositol : 5mL - Than hoạt tính: 0,25g
5mL - Vitamin B1: 5mL - pH: 5,5
- Skoog II MS : 2mL - Đường: 30g - Agar: 6g
* Khoáng đa lượng của KnudsonC (Morel,G.M.,1965)
- NH4NO3: 500mg/L - KCl : 250 mg/L
- NH4(SO4)2: 500mg/L - KH2PO4: 250 mg/L
- Ca(NO3)2: 241,3mg/L - MgSO4: 122,15mg/L
* Khoáng vi lượng của Heller (1953)
- AlCl3.6H2O : 0,054 mg/L - CuSO4.5H2O : 0,03 mg/L
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 18 - Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử - 19 - Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
- H3BO3: 6,2 mg/L - NiCl2.6H2O : 0,03 mg/L
- KI : 0,01 mg/L - ZnSO4.7H2O :1,0 mg/L
- MnSO4.H2O : 0,08 mg/L
2.3.3 Các bước tiến hành:
- Rửa sạch chồi Dendrobium dưới vòi nước chảy. Dùng dao mổ lột hết các lá non bao xung
quanh chồi cho đến khi để lộ ra các chồi bên và chồi ngọn
- Ngân chồi trong nước xà phòng loãng và dùng gòn lau nhẹ lên thân chồi. Rửa cho sạch xà
phòng dưới vòi nước chảy
- Lắc chồi trong cồn 70% trong 1 phút. Sau đó xử lý với dung dích javel thương phẩm theo tỉ
lệ 1:5 trong vòng 25-30 phút
- Trong tủ cấy, dùng kẹp vô trùng cho chồi vào các bécher có chứa nước cất vô trùng. lắc như
thế 3-5 lần cho hết mùi javel.
- Đặt các chồi lên giấy vô trùng.dùng dao cắt riêng từng chồi bên và chồI ngọn ra khỏi chồi
mẹ ban đầu. Nhớ cắt bỏ hết các mô chết đã bị chất khử trùng làm trắng ở phần gốc chồi. Cấy
từng chồi vào ống nghiệm có chứa môi trường đã chuẩn bị.
- Nuôi trong phòng sáng
- Ghi rõ tên nhóm, ngày cấy, giống cây vào tất cả các ống nghiệm
2.4 Yêu cầu
- Thực hiện tốt thao tác cấy vô trùng và khử trùng mẫu
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 19 - Biotechnology
Thí nghiệm Sinh học phân tử - 20 - Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm
BÀI 5:
NUÔI CẤY MÔ SẸO
Ẹ^ ! ^
1. GIỚI THIỆU
Nuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào. Mô sẹo là nguyên liệu khởi
đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy
tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính
sinh học…Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô và các cơ quan
phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (có vết thương, xử lý các chất điều hoà sinh trưởng thực
vật…). Các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quan này phải chịu một sự phản phân hóa trước lần
phân chia đầu tiên. Nhìn chung sự tạo mô sẹo invitro (nhờ auxin tác động) do 3 quá trình:
- Sự phản phân hóa tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan) bao gồm các tế bào nhu
mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi.
- Sự phân chia của các tượng tầng: các tế bào tượng tầng của phần lớn STD dễ dàng phân
chia dưới tác động của auxin thấm chí không cần auxin ngoại sinh như ở các loài cây cỏ hay dây
leo.
- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) quá trình này được ưu tiên áp dụng
ở ĐTD, vì các cây này tượng tầng thiếu và nhu mô khó phản phân hoá so với STD Màu sắc của
mô sẹo không giống nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau hay trên các bộ phận khác
nhau và chúng thường có màu vàng, trắng, nâu hay trắng xanh…
Nồng độ và loại kích thích tố sử dụng trong môi trường nuôi cấy là những yếu tố có ảnh
hưởng đến sự hình thành và phát triển mô sẹo. Thường mô sẹo được hình thành trên môi
trường giàu auxin; có thể dùng auxin riêng rẽ hay kết hợp với nhau hoặc có thể kết hợp với
cytokinin tuỳ từng loại cây.
Hàm lượng hormon nội sinh và chiều di chuyển của các hormon này trong mẫu cấy có ảnh
hưởng đến sự phát sinh mô sẹo. Vì vậy nguồn mẫu cấy, việc lấy mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy
trên môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo dẫn đến những phản ứng khác
nhau của mẫu cấy.
Với một số cây thì vấn đề này không quan trọng nhưng cũng có một số cây chịu ảnh hưởng
rất lớn.
2. THỰC HÀNH
2.1. Mục đích:
Khảo sát sự phát sinh mô sẹo từ các bộ phận khác nhau ở cây thuốc lá
2. 2 Vật liệu
2.2.1 Môi trường nuôi cấy
MS (20g/l đường) có bổ sung 0.1µM 2,4-D và 1µM 2,4-D
2.2.2 Nguyên liệu thực vật
Cây con thuốc lá in- vitro
2.2.3 Hoá chất và dụng cụ
- Nuớc cất vô trùng
- Dao, kẹp, đĩa cấy, giấy cấy…
2. 3. Các bước thực hiện
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 20 - Biotechnology