Báo cáo " Lập nhiễm sắc Đồ tế bào động vật"
Kỹ thuật phân tích bộ NST cho phép các nhà di truyền học quan sát dưới kính hiển vi các
NST ở giai đoạn metaphase, từ đó đếm số lượng và quan sát các biến đổi trong cấu trúc NST
để biết được kiểu nhân.
Phân tích kiểu nhân nhằm xác định các bất thường bẩm sinh hoặc các bệnh liên quan đến
NST.
Phân tích karyotype có thể được tiến hành trên tất cả các tế bào có nhân, từ các mô nuôi
cấy hay từ các khối u, nhưng các NST thu nhận từ bạch cầu máu ngoại vi được sử dụng
nhiều nhất do...
Họ Và Tên: Vũ Đình Kỳ
MSSV: 0615056
Nhóm: II
Báo cáo kết quả thực tập
Lập Nhiễm Sắc Đồ Tế Bào Động Vật
A. Báo cáo kết quả bài thực tập.
I. Mục Đích
Trình bày được kỷ thuật lạm nhiểm sắc thể (NST).
Nhuộm được tiêu bả, quan sát được cụm nhiểm sắc thể kỳ giữa ở vật kính x40
Quan sát phát hiện đột biến trên NST của tế bào MCF-7.
II. Cơ Sở Lý Thuyết
Kỹ thuật phân tích bộ NST cho phép các nhà di truyền học quan sát dưới kính hiển vi các
NST ở giai đoạn metaphase, từ đó đếm số lượng và quan sát các biến đổi trong cấu trúc NST
để biết được kiểu nhân.
Phân tích kiểu nhân nhằm xác định các bất thường bẩm sinh hoặc các bệnh liên quan đến
NST.
Phân tích karyotype có thể được tiến hành trên tất cả các tế bào có nhân, từ các mô nuôi
cấy hay từ các khối u, nhưng các NST thu nhận từ bạch cầu máu ngoại vi được sử dụng
nhiều nhất do thời gian nuôi cấy ngắn.
Để quan sát được NST, các tế bào cần được nuôi cấy trong môi trường đầy đủ chất dinh
dưỡng với sự hiện diện của chất kích thích phân bào phytohaemagglutinin (PHA) chiết xuất
từ cây Phaseolus vulgaris. Chất này tác động lên thụ thể của các tế bào lympho tạo một đáp
ứng miễn dịch, kết quả là các tế bào lympho tiến hành phân chia và sản xuất cytokine.
Sau 48 giờ hay 72 giờ được nuôi cấy, Colcemid được thêm vào môi trường để ngừng quá
trình phân chia tế bào ở giai đoạn metaphase.
Các tế bào thu nhận được xử lý nhanh với dung dịch nhược trương để làm nhân tế bào
phồng lên, giúp kỹ thuật viên dễ dàng nhận diện mỗi NST.
Hiện nay có rất nhiều kỹ thuật nhuộm NST nhưng trong bài thực tập giới thiệu phương
pháp nhuộm Giemsa banding (G-banding). Đây là phương pháp nhuộm NST phổ biến và ít tốn
kém. Phương pháp nhuộm G-banding giúp phân biệt từng NST một cách dễ dàng dựa vào sự
bắt màu đậm nhạt đặc trưng của mỗi đoạn NST.
Kỹ thuật nhuộm và lập karyotype có thể ứng dụng trong các lĩnh vực sau:
⇒ Chuẩn đoán bệnh di truyền.
⇒ Xác định các tác nhân gây đột biến NST.
⇒ Xác định mức độ tác động của một tác nhân đã biết.
Một số trường hợp được chỉ định làm karyotype:
⇒ Nghi ngờ hội chứng NST cổ điển như: hội chứng Down, đa dị tật…
⇒ Cá thể hoặc thai bị dị dạng bẩm sinh
⇒ Tất cả các con cái của bố/mẹ có sai lệch cấu trúc NST
⇒ Vợ chồng có hơn hai lần sảy thai
⇒ Sảy thai, chết sinh bất thường
⇒ Vô sinh
⇒ Chậm phát triển thể chất và trí tuệ
⇒ Bất phân định giới
⇒ Những trường hợp tiếp xúc với tia phóng xạ…
Tiêu chuẩn xếp loại bộ NST người: dựa vào tiêu chuẩn chiều dài tương đối của NST, vị
trí phần tâm, NST có hay không có eo thắt thứ 2, có hay không có vệ tinh, 46 NST của người
được chia làm 23 cặp, chia thành 7 nhóm theo kích thước giảm dần.
⇒ Nhóm A: NST 1, 2, 3; là các NST có kích thước lớn nhất, NST 1 và 3 có tâm
giữa, NST 2 có tâm gần giữa. NST 1 có thể có thêm eo thắt thứ hai ở nhánh dài
gần tâm
⇒ Nhóm B: NST 4, 5; là các NST có kích thước lớn và có tâm gân đầu
⇒ Nhóm C: NST 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12; là các NST có kích thước trung bình, tâm
gần giữa
⇒ Nhóm D: NST 13, 14, 15; là các NST có kích thước trung bình, tâm đầu
⇒ Nhóm E: NST 16, 17, 18; là các NST tương đối ngắn. NST 16 tâm giữa, NST 17
tâm gần giữa nhưng lệch hơn NST 16, NST 18 tâm gần đầu.
⇒ Nhóm F: NST 19, 20; là các NST ngắn, tâm gần giữa
⇒ Nhóm G: NST 21, 22 và NST giới tính. NST 21, 22 rất ngắn, tâm đầu. NST Y
có tâm đầu, trên nhánh dài có eo thắt thứ 2 nằm ở phần giữa nhánh dài.
III. VẬT LIỆU:
1. Hóa chất:
⇒ Môi trường nuôi tế bào
⇒ Dung dịch Trypsin/EDTA
⇒ Dung dịch Trypsin 0.5%
⇒ Dung dịch nhược trương KCL 0.075M
⇒ Dung dịch cố định mẫu (3 Acid acetic : 1 Methanol)
⇒ Colcemid
⇒ Thuốc nhuộm Giemsa 5%
⇒ Nước cất
⇒ Cồn 700, cồn 900
⇒
2. Dụng cụ:
⇒ Ống ly tâm 15ml
⇒ Bercher 50 ml, 100 ml
⇒ Lame, lamelle
⇒ Micropippette
⇒ Pipette Pastuer
⇒ Bông gòn, khăn thấm
3. Thiết bị:
⇒ Máy ly tâm
⇒ Tủ lạnh
⇒ Kính hiển vi quang học
⇒ Tủ ấm
⇒ Cân phân tích
IV.PHƯƠNG PHÁP:
• Tiến hành nuôi cấy tế bào MCF-7. Khi mật độ tế bào đạt 70-80%, thay môi trường.
• Bổ sung dung dịch colcemid vào bình nuôi tế bào sao cho nồng độ colcemid cuối cùng
đạt 0,2 μg/ml, ủ 20-40 phút, sau đó loại bỏ môi trường có chứa colcemid.
• Tách tế bào bằng dung dịch trypsin/EDTA 0.25%, ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút,
loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào.
• Huyền phù tế bào vào 6 ml dung dịch nhược trương KCl 0.075M, ủ 15 phút ở 37 0C, ly
tâm 1800 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn tế bào.
• Huyền phù cặn tế bào vào 6 ml dung dịch cố định mẫu lạnh Carnoy (methanol: acetic
3:1), trộn kỹ, ủ 6 phút ở 40C, ly tâm 1800 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn tế bào. Lập
lại thao tác này 3-4 lần. Thu cặn tế bào, bổ sung 1ml dung dịch cố định mẫu.
• Chuẩn bị lam sạch, không mờ (xử lí kính với NaOH 1N trong 24h, HCL 1% trong 24h,
cồn 900 trong 24h). Các lam kính để lạnh 1h trước khi làm tiêu bản.
• Làm tiêu bản
⇒ Nhỏ dịch chứa tế bào đã cố định lên lame, cách lame 50 cm, để khô tự nhiên.
⇒ Nhuộm Giemsa 5% trong 5 phút, rửa nhanh bằng nước cất, để khô tự nhiên.
⇒ Quan sát bằng kính hiển vi với vật kính 40x.
V. Kết Quả và biện luận
Kết quả quan sát sau khi nhuộm không thấy tê bào nào
Nguyên nhân: Do mật độ tế bào ít kết hợp với các thao tác ly tâm và hút bỏ dịch nổi đã làm
mất tế bào cùng với quá trình rửa sau khi nhuộm quá mạnh đã làm chôi tế bào nên khi quan sát
ta không thấy kết quả nào cả.
B. Đọc công thức của bộ NST sau:
5~59,XX,der(1)t(1;7)(p11;q11),+der(1)t(1;10)(q21;p11),+2,+der(3)t(1;6)(?;?)t(6;22)
(?;?)t(3;22)(p21;?),+der(3)t(3;19)(p21;?),+5,der(6)t(6;17)(p23;?q23),+der(6)t(6;7)
(p10;q10)del(6)(q31),+der(6)t(6;19)(q10;?q10)del(6)(q16),der(8)t(8;15)(q2?4;q15)del(15)
(q25),+der(8)t(8;18)(p12;?),+9,+del(9)(q12),+der(9)t(4;9)(q32;q21),der(11)t(8;11)(?;p15),
+der(11)t(11;13)(q10;q10),+13,der(14)t(1;14)(?;p12),+der(16)t(14;16)(q24;q12),
+der(18)t(10;18)(?;p10),der(18)t(18;19)(q10;p10),der(20)t(20;21)(q13;q11)x2],
+der(20)t(17;20)(?;q13),der(20)t(17;20)(?;q13)del(20)(p11),-21,i(22)(q10)
Nữ, 45~59 NST, đột biến NST 1 trong đó có sự chuyển vị giữa vì trí 11 ở cánh ngắn NST
1 với vị trí 11 ở cánh dài NST 7, có thêm một NST số 6 trong NST này có đột biến chuyển vị
giữa vị trí 21 ở cánh dài NST 1 và vị trí 11 cánh ngắn NST 10, thêm một NST 2, thêm một NST
3 trong đó có đột biến chuyển vị giữa một đoạn chưa biết trên NST 1 với NST 6 và chuyển vị
không một đoạn chưa biết trên NST 6 và NST 22 và chuyển vị giữa vị trí 21 cánh ngắn NST 3
với một đoạn chưa biết trên NST 22, thêm NST 3 đôt biến trong đó có đột biến chuyển vị
giữa vị trí 21 trên cánh ngắn NST 3 với vị trí chưa biết trên NST 19, thêm một NST 5, đột
biến NST 6 trong đó chuyển vị giữa vị trí 23 trên cánh ngắn NST 6 với vị tri 23 không sác định
trên cánh dài NST 17, thêm một NST 6 đột biến trong đó có đột biến chuyển vị giữa vị trí 10
trên cánh ngắn NST 6 với vị trí 10 trên cánh dài NST 7 mất một đọan tại vị trí 31 trên cánh dài
NST 6, thêm NST 6 đột biến tróng đó có đột biến chuyển vị giữa vị trí 10 trên cánh dài NST 6
với vị trí 10 không sác định trên cánh dài NST 19 mất một đoạn tại vị trí 16 trên cánh dài NST
6, đột biến NST 8 tróng đó có sự chuyển vị giữa vị trí số 2 hoặc số 4 trên cánh dài NST 8 với
vị trí 15 trên cánh dài NST 15 mất một đoạn tại vị trí 25 trên cánh dài NST 15, thêm 1 NST 8
đột biến trong đó có sự chuyển vị giữa vị trí 12 trên cánh ngắn NST 8 với vị trí không sác định
trên NST 18, có thêm một NST 9, có thêm một NST 9 đột biến mất đoạn tại vị trí 12 trên cánh
dài, thêm một NST 9 đột biến trong đó có đột biến chuyển vị giữa vị trí 32 trên cánh dài NST
4 với Vị trí 21 trên cánh dài NST 9, đột biến NST 11 trong đó ó sự chuyển vị một đoạn chưa
biết trên NST 8 với vị trí 15 trên cánh ngắn NST 11, thêm một NST 11 đột biến trong đó có
sự chuyển vị giữa vị trí 10 trên cánh dài NST 11 với vị trí 10 trên cánh dài NST 13, thêm một
NST 13, thêm một NST 14 đột biến trong đó có sự chuyển một đoạn không sác định trên NST
1 với vị trí 12 trên cánh ngắn NST 14, có thêm một NST 16 đột biến trong đó có sự chuyển vị
giữa vị trí 24 trên cánh dài NST 14 với vị trí 12 trên cánh dài NST 16, có thêm một NST 18 đột
biến trong đó có sự chuyển vị một đoạn không sác định trên NST 10 với vị trí 10 trên cánh
ngắn NST 18, độ biến NST 18 trong đó có sự chuyển vị giữa vị trí 10 trên cánh dài NST 18
với vị trí 10 trên cánh ngắn NST 19, đột biến hai lần trên NST 20 trong đó có sự chuyển vị
tris13 trên cánh dài NST 20 với vị trí 11 trên cánh dài NST 21, có thêm một NST 20 đột biến
trong đó có sự chuyển vị một đoạn không sác định trên NST 17 với vị trí 13 trên cánh dài NST
20, đột biến NST 20 có sự chuyển vị một đoạn không sác định trên NST 17 với vị trí 13 trên
cánh dài NST 20 và NST 20 mất một đoạn tại vị trí 11 trên cánh ngắn, mất một NST 21, đột
biến lặp đoạn tại vị trí 10 trên cánh dài NST 22
C. Viết công thức của người có bộ nhiễm sắc thể như sau:
Nữ, 50~59 NST, bị hội chứng Turner, mất một đoạn tại vị trí band 22 cánh dài NST X,
NST 2 có nhiều đột biến trong đó có sự chuyển vị giữa band 22 cánh dài NST 2 và band 21
cánh dài NST 12 và sự chuyển vị giữa band 10 cánh dài NST 2 và band 10 cánh dài NST 12, có
thêm 1 NST 6 bị mất đoạn tại vị trí band 1?3 cánh dài, có thêm 1 NST 7, mất 2 NST 8, có thêm
1 NST 18 đa đột biến gồm chuyển vị giữa một đoạn chưa biết trên NST 15 và band 11.3 cánh
ngắn NST 18 và chuyển vị giữa một đoạn chưa biết của NST X hoặc NST 7 với band 21 cánh
dài NST 18…
50~59, XO, -del(X)(q22), der(2)t(2; 12)(q22; q21)t(2; 12)(q10; q10),+del(6)(q1?3), +7, -8,
-8, +der(15; 18)(?; p11.3)t(X?7; 18)(?; q21)…
